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miR155 沉默促进 ox-LDL 诱导的脐静脉内皮细胞炎症因子的表达及凋亡华中科技大学同济医学院附属协和医院心血管外科 研究生：王博导师：肖诗亮 教授中文摘要第 I 部分原代脐静脉内皮细胞的分离培养以及内皮细胞的miR155 沉默目的 探讨人的原代脐静脉内皮细胞的体外分离培养的方法并且鉴定其表型以 及建立 miR155 在原代脐静脉内皮细胞中被沉默的细胞模型。方法 选择对象为无高血压、糖尿病等疾病的待产孕妇，生产时取其足月产胎儿 脐带一条，将其置于装有 4℃预冷生理盐水的 50ml 离心管中，在超净台中将脐 带移入培养瓶中，用含有肝素的生理盐水冲洗 3 次，直到脐带变为透明乳白色 后，将 II 型胶原酶用注射器注射入脐带中进行消化，并且将一整套脐带与尿袋 的连接装置放在 37℃温箱中消化 30min 后拿出来，加入含有 10%左右的高级澳 洲胚胎牛血清的内皮细胞专用培养基（ECM）进行细胞培养并且待细胞长至培 养板 80%时传代，取 2~4 代细胞作为干预及转染用。根据 Genbank 中人的 miRNA155 基因信息，由上海生物工程公司合成基因序列，将所得序列的互补 序列酶切后鉴定。将扩增片段与病毒载体连接，并将该复合体转化进入感受态1的大肠杆菌，增长出克隆后经过基因测序得出碱基排列顺序或者进行 PCR 鉴定克隆结果是否为所要求范围内的基因片段。结果 从普通光学显微镜下观测脐静脉内皮细胞（HUVECs）的外形特征，并且 经过 vWF 免疫荧光染色证明从脐带中消化出来的细胞符合内皮细胞的形态特 征及免疫学荧光表现。将包装好的病毒载体进行基因测序，检测酶切重组后的 序列是否为所需的序列，经证实重组序列为目的序列。结论 HUVECs 的分离与培养以及 miR155 在 HUVECs 中沉默的体外模型的构建， 为 miR155 在内皮中的作用提供了一个研究的基础。关键词脐静脉内皮细胞；miR155；慢病毒转染2第 II 部分 miRNA155 沉默后脐静脉内皮细胞炎症因子的表达及凋亡的改变目的 观察 miR155 沉默后对脐静脉内皮细胞由 ox-LDL 诱导的炎症因子的表达 及内皮细胞凋亡的影响。方法 用 ox-LDL 诱导脐静脉内皮细胞凋亡以及炎症因子的表达，通过 Tunel 分 别检测内皮细胞 0h、24h、48h 时的凋亡率，用 IPP6.0 软件计数凋亡细胞，通过 对比观察 miR155 沉默组的细胞凋亡率的改变。Western blot，RT-PCR 分别测量 ICAM-1，VCAM-1 在蛋白质水平与信使 RNA（mRNA）水平的表达。高迁移速 率电泳（EMSA）检验 NFκB 与相应 DNA 结合的转录活性。结果 ox-LDL 刺激内皮细胞构建的细胞凋亡以及相关下游的炎症因子表达的体 外模型中，miR155 沉默组的 VCAM-1，ICAM-1 的蛋白以及 mRNA 的表达程度 明显高于正常组（Control 组），NFκB 与相应 DNA 结合的转录活性明显提高。 凋亡的计数沉默组高于正常组与空白病毒对照组。结 论 建立 脐静脉内皮细胞 miR155 沉默的体外细胞模型，实验结果提示 HUVECs 中 miR155 沉默后内皮细胞 48h 内凋亡率明显增加并且 ox-LDL 诱导的 ICAM-1、VCAM-1 相关炎症因子的表达增加，进一步检测 NFκB 在 24h 的 DNA 结合活性提示转染组明显提高，这些均说明 miR155 在 HUVECs 的凋亡以及相关 炎症因子的表达中起重要的作用。关键词 低密度脂蛋白; ICAM-1; VCAM-1; 凋亡；NFκB3Silencing of miR155 enhances the apoptosis and promotes the expression of inflammation factor in HUVECsDepartment of Cardiovascular Surgery，Union Hospital, Tongji Medical CollegeHuazhong University of Science and TechnologyPostgraduate：Wang BoTutor：Prof. Xiao Shi-liangPart IThe isolation and cultivation of umbilical vein endothelial cells and the silence modle of miR155 in vitroAbstractObjective To explore original generation of human umbilical vein endothelial cells of cul