p16、hpv、ck20在宫颈癌淋巴结微转移中的表达及意义word论文.docxVIP

是一种嗜上皮性病毒，高危型HPV作为宫颈癌的病因已被公认，但对宫颈癌患者盆腔淋巴结HPV表达情况与宫颈癌微转移相关性的研究尚无定论。本文拟通过宫颈癌患者术后盆腔淋巴结中HPV、P16、CK20的免疫组化表达情况，以期能为临床提供一种便捷的宫颈癌微转移的检测方法。1.1临床资料1.1.1研究对象临床资料资料与方法2009年1月～2011年12月在贵州省肿瘤医院妇瘤外科住院并且接受广泛子宫切除+盆腔淋巴结清扫术治疗，术前未接受过放化疗的患者，FIGO2009分期在IB1～IIA1 239例。其中术后常规病理检查发现盆腔淋巴结转移者20例为研究组1；术后常规病理检查未见盆腔淋巴结转移，无脉管间质侵润等高危因素，但随访期内（1～3年）出现复发者10例为研究组2；选择同期术后常规病理检查无盆腔淋巴结转移、无脉管间质侵润等高危因素，随访期无复发的患者30例为对照组，三组患者术前行宫颈凯普导流杂交DNA法检测HPV均为阳性。患者资料见表1。表1研究对象的临床资料Table1The clinicaldatas of studyobjects年龄（平均年龄）术前分期术后病理术后补充治疗随访复发IB1IB2IIA1鳞癌腺癌研究组116-50岁39.2岁839182均补充放疗3例复发研究组223-25岁 40.3岁14591无10例复发对照组35-55岁 37.5无复发1.1.2研究对象随访情况：在随访期（1～3年）内，研究组1中发现3例复发，2例为阴道残端复发，1例为盆腔复发，复发后行放射补充治疗，目前均存活。复查该组患者术后常规病理检查HE染色蜡片发现转移盆腔淋巴结髂内10枚，闭孔8枚，髂总1枚，髂外1枚。根据转移病灶大小，其中小于2mm的微转移病灶7枚，直径较大的转移灶13枚。研究组2随访期内发现9例为中心型复发（阴道残端病检证实，无盆腔淋巴结复发的证据），1例为盆腔内复发，复发患者7例接受放射治疗，接受5治疗的患者有2例病情进展，出现远处转移（其中1例为宫颈鳞状细胞癌IB2期，1例为宫颈鳞状细胞癌IIA1期），未接受补充放疗者1例死亡（为宫颈腺癌IB2期），2例进展（其中1例为宫颈鳞状细胞癌IB2期，1例为宫颈鳞状细胞癌IIA1期）。对照组随访期限内均未发现复发。1.2实验标本：自贵州省肿瘤医院病理科档案室调出需进行研究的3组宫颈患者盆腔淋巴结的封存石蜡片，由贵州省肿瘤医院两位主治以上高年资医师复核确定为研究对象的术后病理标本，每例患者均有双侧髂总、髂外、髂内、闭孔淋巴结。研究组1每例患者取有淋巴结转移的蜡片一块，共20块；研究组2和对照组于双侧髂总、髂外、髂内、闭孔每个部位各取一块淋巴结蜡片，研究组2共80块，对照组共240块，以上蜡块备切片检查。1.3实验试剂：即用型非生物素免疫组化Envision super检测试剂盒（DAKO公司产品）。P16抗体（北京生物技术公司合成）。HPV抗体（北京生物技术公司合成）。CK20抗体（北京生物技术公司合成）。DAB显色试剂盒（福州迈新生物技术有限公司）。其他常用试剂为贵州省肿瘤医院病理科备用。1.4主要仪器和设备：电磁炉美的公司冰箱德国西门子切片机德国莱卡公司显微镜日本olympus公司照相系统日本olympus公司载玻片、盖玻片盐城耀华玻璃仪器厂电热恒温培养箱上海跃进医疗器械厂高压锅上海跃进医疗器械厂微量移液枪(1000μl、100μl、10μl)Eppendorf公司1.5实验步骤及方法：实验流程：6实验流程如下图示：研究组1（20块蜡片）研究组2（80块蜡片）对照组（240块蜡片）每块蜡片常规切片6张，取3张取5块蜡片分别连续切片10张每块蜡片常规切片6张，取3张取5块蜡片分别连续切片10张每块蜡片常规切片6张，取3张取5块蜡片分别连续切片10张免疫组化染色HE免疫组染色化染色HEHE免疫组染色染色化染色阳性蜡块阴性蜡块阳性蜡块阴性蜡块连续切片连续切片将备检查的石蜡切片每块行常规切片6张，其中1张备用片，一张用PBS缓冲液代替一抗，作为阴性对照，一张进行HE染色，其余3张分别用于CK20、P16、HPV免疫组化染色。对照组、研究组2的切片如P16、CK20、HPV任一表达阳性则取该枚淋巴结行连续切片HE染色10张，厚5um，如三者均不表达，则研究组1、研究组2、对照组各取5枚淋巴结行连续切片HE染色法。实验方法：HE染色：1)石蜡切片65℃烤片40min；2)三缸二甲苯，分别5min，95％酒精Ⅰ、Ⅱ脱二甲苯各1min；3)苏木精染色5min，自来水冲洗1min；4)1％盐酸酒精1～3s，自来水冲洗5～10s；5)饱和碳酸锂水溶液复蓝15～20s，自来水冲洗1min；6)1％伊红染色20s，自来水冲洗1min；77)80％酒精，90％酒精，95％酒精，无水酒精各2～3s