核酸分子杂交技识介绍与讲解.ppt

3. ABC显色体系 DNA-B+SA-AP→DNA-B-SA或 DNA-B+SA+BAP→DNA-B-SA-BAP SA：streptavidin(链霉亲合素) BAP：生物素化的磷酸酶 B：biotin(生物素), ABC:avidin-botin-enzyme complex(亲合素-生物素-酶复合物)。 4.非放射发光自显影 若将AP或HRP的显色底物根据光化学原理换成一种酶解后产生的光子的化合物，可用自显影技术曝光X线片显示。 HRP发光自显影：氨基苯-甲酰肼在HRP与H2O2作用下氧化为氨基苯二甲酸，同时放出N2及发光。 AP发光自显影：发光底物金刚烷二氧丁环磷酸盐（AMPDD），其磷酸二脂键在AP作用下水解一个磷酸，进而由分子内过氧键提供能源分解并产生金刚酮和激发态的甲基间-氧苯甲酸阴离子，恢复到基态时发光。 五、核酸分子杂交方法和类型 （一）、固相膜核酸分子杂交 将参加反应的一条核酸链先固定在固体支持物上，一条反应核酸链游离在溶液中。 固体支持物有硝酸纤维素滤膜、尼龙膜、乳胶颗粒，磁珠和微孔板等。杂交后未杂交的游离片断容易洗去，膜上留下的杂交物容易检测，并能防止和DNA自我复性等优点，故该法最为常用。 类型：菌落原位杂交、斑点杂交、狭缝杂交、Southern印迹杂交、Northern印迹杂交、细胞或组织原位杂交和夹心杂交等。 方法： 1. DNA变性：变性能使DNA双链解开，常用SSC（0.1mol/L SSC, 15mmol NaCl-1.5mmol 柠檬酸三钠）碱变性。 2. 膜上固定： 20×SSC中转膜-毛细现象，固定，80℃下，2小时或紫外线下1分钟（Cross link）。 3. 预杂交：塑料袋中预热60℃，预杂交液中：6×SSC，0.01molEDTA，5×Denhardt氏液，0.5％SDS，100 μg/ml变性鲑鱼精DNA 4. 杂交：杂交液中的组成：6×SSC，0.01molEDTA，5×Denhardt氏液，0.5％SDS，100 μg/ml变性鲑鱼精DNA及探针。 5. 洗膜：2×SSC-0.5％SDS， 0.1×SSC-0.5％SDS，60℃ 2小时。 6. 显色：放射自显影；感光显影。 种类： A：菌落原位杂交(Colony in situ hybridization)：是将细菌从培养平板中转移到硝酸纤维素膜上，然后再将滤膜上的菌落裂解以释放出DNA。将DNA烘干固定膜上与标记的探针杂交，放射自显影，检测杂交信号，与平板上的菌落对位。 B：斑点杂交(Dot blot)：是将被检标本点到膜上，烘烤固定，简便，快速，可做半定量分析，一张膜上可同时检测多个样品。 C： Southern 印迹杂交(Southern blot)：将DNA标本用限制性内切酶消化后，经琼脂糖凝胶电脉分离各酶解片断，然后经碱变性，Tris缓冲液中和（及）高盐下通过毛细作用，将DNA从凝胶中转印到硝酸纤维滤膜上，烘干后即可用于杂交。杂交后放射自显影显示与探针互补的DNA酶解片断。是研究DNA图谱的基本技术，在遗传病诊断、DNA图谱分析及PCR产生分析生平方面有重要价值。 D：Northern印迹杂交(Northern blot)：是一种将RNA从琼脂糖凝胶中转印到硝酸纤维膜上的方法。转印方法与DNA相似，但是在进样前用甲醛使RNA变性，而不用NaOH，因为会水解RNA的2’-羟基团。 E：组织原位杂交：简称原位杂交，指组织或细胞的原位杂交，组织或细胞经适当的处理后使细胞通透性增加，让探针进行细胞与DNA或RNA杂交，因此可以确定探针的互补序列在细胞内的空间定位，具有重要的生物学和病理学意义。染色体DNA杂交可显示特定序列在染色体上的定位，与RNA杂交或显示特定RNA在细胞中或组织中的定位。探针可以是双链或单链DNA，也可是RNA探针。长度以100-400nt为宜。寡核苷酸探针（16-30nt）能自由地出入细胞和组织细胞壁，杂交效率明显高于长探针，是优选探针。 （二）、液相杂交 参加反应的两条核酸链都在溶液中，是一种最早且操作简便的杂交类型，虽有时被应用，但不如固相杂交普遍，其原因是杂交后的过量未杂交探针在溶液中去除较为困难和误差较高。近来有商业性基因探针诊断盒的应用。 原位核酸分子杂交技术 原位核酸分子杂交技术简称原位杂交(in situ hybridization)，是应用已知碱基顺序并带有标记物的核酸探针与组织、细胞中待检测的核酸按碱基配对的原则进行特异性结合而形成杂交体，然后再应用与标记物相应的检测系统，通过组织化学或免疫组织化学方法在被检测的原位形成带颜色的杂交信号， 在显微镜或电子显微镜进行细胞内定