条件性基因敲除小鼠的设计.doc

条件性基因敲除小鼠的设计利用了Cre/LoxP或Flipe/Frt原理。它们都是位点特异性重组酶系统。这里以Cre/LoxP系统为例。比如在待敲除的一段目标DNA序列的两端各放置一个loxP序列，得到flox（flanked by loxP)小鼠。将flox小鼠与带有细胞特异性表达Cre的小鼠交配繁殖，以获得在特定细胞里把目标基因敲除掉的小鼠，即条件性基因敲除小鼠。此外，若与控制Cre表达的其他诱导系统（比如CreERT2）相结合，还可以对某一基因同时实现时空两方面的调控。 Cre／loxP系统来源于噬菌体，可以介导位点特异的DNA重组。该系统含有两个组成成分：一个是一段长34bp的DNA序列（LoxP序列），含有两个13 bp的反向重复序列和一个8 bp的核心序列。 LoxP的方向由中间这8个碱基决定。这段LoxP序列是Cre重组酶识别的位点。 令一个组成部分是Cre重组酶。它是由噬菌体编码的一种由343个氨基酸组成的蛋白。Cre可以介导两个LoxP位点的重组，从而引起两个LoxP之间DNA序列的缺失。如果将Cre重组酶cDNA通过基因工程的手段置于组织或细胞特异性启动子之下，可以得到Cre组织/细胞特异性表达的Cre小鼠，也叫Cre工具小鼠。 跟Flox小鼠交配之后，可以得到条件性基因敲除小鼠。 所谓Flox小鼠是指在某个基因的某个外显子两侧各放一个LoxP序列。这段序列就是Flanked by LoxP，也就叫做Flox小鼠。这种Flox小鼠一般要通过设计构建打靶载体、胚胎干细胞重组、囊胚显微注射、和嵌合体小鼠传代来获得。这种小鼠跟Cre工具小鼠交配，由于Cre的表达，介导两个LoxP位点序列的重组，从而敲除两个LoxP之间的序列。由于不同Cre工具小鼠的Cre表达有组织/细胞特异性，就可以达到在不同组织、细胞里特异性敲除目的基因的目标。比如上皮细胞、胸腺细胞、T细胞、B细胞、心肌细胞、肠道、肺脏等。 那如何设计条件性基因敲除小鼠呢？这里所说的设计主要是Flox小鼠的设计。所谓条件性敲除，是说除了特定细胞外，其它细胞里面没有任何的基因表达异常。一般情况下，不要在第一个外显子前面放置LoxP序列。因为第一个外显子前面一般是启动子。放置LoxP序列有可能会破坏或改变启动子活性。条件性敲除一般是敲掉最早引起移码突变的外显子。这样的话，最好不要敲除有起始密码子ATG的外显子。否则的话，基因可能会利用ORF内的ATG编码一个缺少部分N端序列的蛋白，这个蛋白很可能有全部或部分野生蛋白的功能。在选择要敲除的外显子的时候（各放一个LoxP在一个外显子的两侧），该外显子的碱基数目不能是3N，否则新基因pre-RNA拼接得到的mRNA不能产生移码突变。会产生一个与野生蛋白相比少了一段中间序列的新蛋白。如果一个外显子的碱基数目是3N+1或3N+2，敲除这个外显子之后会产生移码突变，就可以达到基因敲除的目的。筛选要敲除（Floxed）的外显子的时候，一般是从最上游的外显子开始筛选适合敲除的外显子。需要注意的是，一般的DNA分析软件不能确定内含子和外显子的边界，需要仔细核对。95%以上的边界遵循gt/ag边界原则。也可以在Ensembl上查一个基因的外显子和内含子。这个网站上的结果绝大部分是正确的。但也需要仔细核对。毕竟基因敲除小鼠研发是一个时间比较长的过程，需要特别小心。前期做多少的考虑都不嫌多。这些原则只是对一般课题的考虑。特殊情况需要特殊处理。比如，如果只是想敲除一个基因的某个特定domain，或是如果一个基因有一个很大的外显子，这个时候即使这个外显子的碱基数目是3N，也可以对其进行敲除。 C57BL/6小鼠 Inbred Strain H2 Haplotype b 全世界最常用的近交系小鼠，它通常作为自发突变和诱导突变的背景品系。在众多研究领域都有应用，如：心血管、发育生物学、糖尿病、肥胖、遗传学、免疫学、神经生物学。也用于制作转基因小鼠。总体上讲，C57BL/6小鼠 容易饲养，寿命较长，肿瘤发生率较低。它还具有以下特点：可产生食物诱导的肥胖和动脉粥样硬化；容易产生小眼畸形等其他身体畸形；不易发生听源性癫痫；低骨密度；成长过程中有脱发现象；迟发型听力丧失。它还是国际间进行小鼠基因组测序的DNA来源。 BALB/c小鼠 Inbred Strain H2 Haplotype d BALB/c小鼠因其能使浆细胞杂交瘤在体内生长产生单克隆抗体而闻名，还可用于产生免疫后的脾细胞，进而与骨髓瘤细胞进行融合。但其用途不仅仅限于生产单克隆抗体。晚年会发生原发性肺癌、肾癌等多种肿瘤而用于肿瘤学研究；也用于免疫学和炎症的研究；还是常用的免疫缺陷动物裸小鼠和SCID鼠的背景品系；也用于神经生物学研究。  DBA/2小鼠 Inbred S