磁性微球在生物学中的应用.doc

磁性微球在生物学中的应用 一、磁性微球在核酸纯化上的应用 核酸是现代生物学、医学研究中的重要课题。核酸作为遗传信息的携带者，是基因表达的物质基础，除了在生物体正常的生长、发育、和繁殖等生命活动中具有十分重要的作用外，它与生命的异常情况，如肿瘤发生、放射损伤、遗传疾病等也有密切关系。因此核酸是现代生物学、医学研究中的重要课题。无论是进行核酸结构与功能的研究，还是进行基因工程、蛋白质工程，首先需要对核酸进行分离纯化。 超顺磁性磁性微球是细胞分离、鉴定，基因分析，细菌和病毒的病原体诊断，核酸分离分析，蛋白质纯化的一个有效手段。通过寡聚核苷酸[Oligo（dT）]序列或链霉亲和素等将DNA和RNA连接磁性微球表面已开发了许多应用。 1、DNA/RNA结合蛋白分离 在基因表达中，蛋白质也是一个重要角色，然而与DNA/RNA特异性结合得蛋白质通常寿命都很短，且含量少，链霉亲和素修饰的磁珠可用来提取分离DNP/RNP。结合有生物素的DNA或RNA序列与链霉亲和素修饰的磁珠相互作用，蛋白质识别了这些序列，就可在几分钟内结合到固定化DNA/RNA上，这种方法已被用来分离转录因子，限制性内切酶，复制蛋白等。 2、mRNA分离 在研究基因表达中，结合免疫磁性细胞分离和基于磁珠分离后进行逆转录（Reverse transcription）及聚合酶链反应（Polymerase chain reaction， RT-PCR）扩增，是一种强有力的手段。典型哺乳动物一个细胞中只有大约10pg的RNA，而mRNA则仅占总RNA的1－5%。传统的mRNA分离技术含有总RNA纯化，即基于Oligo（dT）-纤维素亲和色谱柱的PolyA+RNA选择，此过程费时并费力。因此，Oligo（dT）25磁性微球被用于从复杂溶菌液中提取mRNA。Poly（A）-tail是mRNA序列上普遍存在的一段碱基，因此磁珠表面只需要有Oligo（dT）25序列，就可以有效地与mRNA上的Poly（A）-tail杂交，这种杂交非常迅速，在1－2分钟内就可完成，能有效地除去rRNA， tRNA以及其他RNA，且有70－100％的回收率。除去溶菌液的洗涤，整个提取只需耗时十五分钟，且只用一个管，也不必前面的纯化步骤。利用Oligo（dT）25磁性微球可在一小时内从单核细胞和T－淋巴细胞，B－淋巴细胞等中提取出mRNA，磁珠也可以经过改性后对血液、骨髓中的癌细胞进行检测或进行单核细胞（mononuclear cell）制备。此外，磁珠还可从动、植物组织中分离Mrna，比如，曾有人从血清、血浆、骨髓液中分理出聚腺苷酸（polyadenylated viral）RNA病毒：HIV-1RNA，从肝、脾、植入石蜡组织，以及果蝇中都提出了mRNA。 利用这些磁珠从动、植物细胞、组织等复杂样品中提取的mRNA，可用于构建cDNA文库。Oligo（dT）25磁珠消除了总RNA纯化，柱色谱处理，过滤，有机溶剂提取，醇沉淀等过程，酶的下游应用也不会因为磁珠的存在而受到抑制。Oligo（dT）25磁性微球最重要的特性还在于可定量提取mRNA，使得定量RT-PCR和环境监测成为可行。实现mRNA提取高通量也已成为可能，Fang和Otto等已报道了96孔板和384孔板磁分离，可同时进行96或384个样品的提取。 二、磁性微球在细胞标记和细胞分离上的应用 细胞分离是生物细胞学研究中一种十分重要的技术，高效的细胞分离在细胞分离是生物细胞学研究中一种十分重要的技术，高效的细胞分离在临床中是首要的、重要的步骤。这种细胞分离技术在医疗临床诊断上有广范的应用，例如治疗癌症需在辐射治疗前将骨髓抽出，且要将癌细胞从骨髓液中分离出来。传统的细胞分离技术主要采用离心法，利用密度梯度原理进行分离，时间长、效果差。随着合成磁性微球的发展，免疫磁性微球在分离细胞方面已经获得了快速的发展，经动物临床试验已获成功。其中最重要的是选择一种生物活性剂或者其他配体活性物质（如抗体、荧光物质、外源凝结素等），根据细胞表面糖链的差异，使其仅对特定细胞有亲和力，从而达到分离、分类以及对其种类、数量分布进行研究的目的。磁性微球用于细胞分离需要考虑以下几个因素；不与非特定细胞结合、具有灵敏的磁响应性、在细胞分离介质中不凝结。Jhunu等人用外源凝结素分别修饰聚苯乙烯磁性微球和白蛋白磁性微球，通过实验发现两者都有分离红细胞的能力，白蛋白磁性微球效率比聚苯乙烯磁性微球的效率高得多，但是成本高。Wedemeyer N等人则将高分子磁性微球结合不同的DNA而可以达到经济快速分离各种不同的细胞的目的。 利用磁流体或超顺磁性物质标记细胞已是体内细胞分离中日趋普遍的方法。多流体或超顺磁性物质标记细胞已是体内细胞分离中日趋普遍的方法。多数当前用的标记技术主要包括以下两种方法：将