第6章 食用菌的基因工程演示课件.ppt

第6章 食用菌基因工程 Section 6 Genetic engineering in edible fungi; 基因工程实际上就是基因重组，就是按照人类的需要把这种生物的“基因”与另外一种生物的“基因进行重新组合，“组装”成新的基因组合，创造出新的物质或生物（基因工程菌）。这种完全按照人的意愿，由重新组装基因表达产生新的物质或新生的生物科学技术，就称为“基因工程”，或者说是“遗传工程”。 　　 　 基因工程是生物工程的一个重要分支，它和细胞工程、酶工程、蛋白质工程和微生物工程共同组成了生物工程。;（1）目的基因； （2）表达元件及表达载体（即将目的基因与质粒或病毒DNA连接成重组 DNA）； （3）转化方法（把重组DNA引入某种细胞）； （4）重组体的筛选（把目的基因能表达的受体细胞挑选出来）。 ;食用菌外源基因表达系统;现有外源基因表达系统的缺陷;酵母表达系统;成本高、工艺复杂；我国20多产家还处于转瓶生产（EPO和乙肝疫苗），年产量不足100g/year； 细胞凋亡难以克服（CHO细胞）;食用菌作为外源基因表达系统的特点;银耳芽孢作为生物反应器具备独特优点;银耳芽孢作为生物反应器具备独特优点;银耳芽孢是高等真核生物，翻译后的蛋白质修饰系统完善，表达高价值的真核生物基因的活性高 银耳芽孢已有完善的高密度深层发酵培养体系 银耳芽孢营养丰富，可食安全;二、载体构建;;;gpd promotor;表达载体: 组成：启动子，终止子，目的基因，抗性筛选标记基因。 ;;Eco RI 5’ -G A A T T C- 3’ 3’ -C T T A A G- 5’;食用菌常用启动子： 1）ras （Le.ras.gene）启动子； 2）gpd(glyceraldehydes-3-phosphate dehydrogenase)启动子； 3）spr1(serine proteinase gene )启动子； 4）trp1（tryptophan synthetase gene）启动子； 5）其他： cel1(cellulose-growth-specific gene )启动子、cel3 启动子、cel4启动子、pri(primase gene )启动子、gla1(glu-coamylase gene )启动子等。;筛选标记 （1）营养缺陷型标记 ： 营养缺陷互补标记基因有: A) ural（二氢乳清酸）基因，杨树菇转化; B) pabl(p-氨基苯甲酸)基因，鬼伞 、蘑菇遗传转化； C）trp2(色氨酸)基因，鬼伞 、蘑菇遗传转化; D）银耳肌醇营养缺陷型菌株。;（2）抗生素抗性筛选标记 ： 抗生素抗性筛选标记已在植物、真菌遗传转化子的筛选上广泛使用。 主要有： 卡那霉素抗性基因（kan+）; 氨苄青霉素抗性基因（Amp+) 潮霉素抗性基因（Hyg+）; 腐草霉素抗性基因（Phl+）; 博来霉素抗性基因（Ble+）。 在培养基中添加抗生素进行筛选。;（3）除草剂和杀菌剂抗性筛选标记 ： A) 如Bialaphos 抗性基因; B)杀菌剂Carboxin抗性基因（CbxR）;;（4）代谢产物抗性筛选标记 如从鬼伞中分离得到的trp3iar基因。该基因是抗氟基吲哚（5-fluoroindole,5-FL）代谢的，草菇和平菇对潮霉素不敏感，而对5-FL十分敏感，当把trp3iar 转入草菇和平菇时，这两种食用菌就能对5-FL产生抗性，达到筛选的目的 。 ;载体构建策略 （１）选择合适的表达载体:含启动子、筛选标记、终 止子 （２）选择合适的限制性内切酶及其酶切位点;;三、遗传转化方法;PEG(polyethylene glycol )法最早是由Davey等以矮牵牛悬浮细胞的原生质体为受体、Krens等以烟草无菌苗分离的原生质体为受体，在PEG的协助下开创性地把裸露的DNA直接转化植物原生质体而创立的，他们的研究结果为基因直接转移到受体细胞奠定了基础。 主要原理：PEG能使细胞膜之间或DNA与膜之间形成分子桥，促使细胞间的接触和粘连，或是通过引起表面电荷的紊乱，干扰细胞间的识别，而有利于细胞间的融合或外源DNA的进入。 主要应用：酵母、蘑菇、平菇、草菇 、鬼伞等 ; 电激法是利用高压电脉冲作用，在原生质体膜上“电激穿孔”（Electroporation）形成可逆的瞬间通道，从而促进外源DNA的摄取。该法自1979年Zimmerann发明以来，经过多年的研究和改进，已广泛应用于动物、植物的遗传转化研究上。1991年，Royer JC等首先采用电激法把编码二