免疫组织化学染色技术中常见问题分析及解决方法.doc

免疫组织化学染色技术中常见问题分析及解决方法 现代检验医学杂志2005年9月第20卷第5期JModLabMed,September2005,Vo1.20,No.541 免疫组织化学染色技术中常见问题分析及解决方法 杨旭,檀艳丽,方川 (河北省职工医学院a.实验中心形态实验室;b.附属医院,河北保定071000) 中图分类号:R446.69文献标识码:A文章编号:1671—7414(2005)05—041—02 免疫组织化学又称免疫细胞化学,是指带显色 剂标记的特异性抗体在组织细胞原位通过抗原抗 体反应和组织化学的呈色反应,对相应抗原进行定 性,定位,定量测定的一项新技术.如今,免疫组织 化学染色技术已成为肿瘤病理诊断中最重要的辅 助手段,但免疫组化染色过程中会出现各种各样问 题,现将此过程中常出现的问题及解决方法分析如 下. 1对照/标本无染色染色结束后,切片中见不到 任何阳性信号.验证和解决阴性染色的问题非常简 单,就是设立阳性对照.如果阳性对照有了表达, 说明染色的全过程和所有试剂都没有问题.如果测 试片仍为阴性,便是真实的阴性,说明组织或细胞 没有相应的抗原表达.反之,如果阳性对照没有着 色,即此阴性结果不是真实的反映为假阴性结果, 表明染色过程中某个或某些步骤出了问题或试剂 出了问题.应一一寻找原因.假阴性结果又可分为 两种情况: 1.1切片中不包含所预期检查的组织或细胞解 决方法:认真核实病理医生是否选错了切片或抗 体,技术员是否选错了蜡块,及时更正以便获得正 确的切片进行染色. 1.2染色过程中的某环节出了问题 1.2.1确认是否忽略了应该加的某种试剂,包括 一 抗,二抗,三抗及底物等,或配制DAB时少了过 氧化氢.为了避免这种简单的错误,有一种简单的 方法:在三抗孵育结束时,将切片上的三抗甩在一 张白纸上,在将配制好的DAB滴一滴在白纸的三 抗上,观察是否出现棕色.如果出现了,证明三抗和 DAB的配制过程没有错误.如果这种DAB再滴到 切片上,没有出现任何阳性信号,问题一定是出在 三抗以前.如果纸上不出现棕色反应,问题肯定在 三抗DAB或DAB的配制过程. 1.2.2确认所有的试剂是否按正确的顺序加入, 是否孵育了足够的时间. 1.2.3对照抗体的标签确认是否使用了正确的抗 体,以及所用的检测系统是否和一抗匹配.比如,如 果一抗是兔来源的抗体,二抗一定要用抗兔的二抗 来匹配;或一抗是小鼠的IgM一抗,二抗必须是山 作者简介:杨旭(1956一),女,河北保定人,实验师. 羊/兔抗小鼠的IgM(不是IgG):抗. 1.2.4检查抗体所使用的稀释度及稀释溶液. 1.2.5检查抗体的有效期和保存条件,现在大多 数试剂公司的抗体均要求在4～8℃条件下保存, 应避免反复冻融,试剂保存时一定要避免与挥发性 有机溶剂同放一室,以免降低抗体的效价. 1.2.6选错抗体,结果阴性,有些抗体只能用于冰 冻组织而不能用于石蜡包埋组织的抗体,应仔细阅 读抗体说明书. 1.2.7检查标本的储存条件,最好用已知阳性的 标本来同时做阳性对照.组织未进行抗原修复,有 的组织必须经过抗原修复才能检测抗原表达. 1.2.8检查色原/底物溶液,最简单的检测方法是 将一滴标记有酶的抗体加入到制备好的底物溶液 中,如果底物发生预期的颜色变化,则可排除底物 的因素. 1.2.9检查复染剂和封片剂是否和所使用的色原 匹配. 2弱阳性如果阴性对照没有染色而阳性对照标 本弱阳性,除了考虑上述因素外,还应考虑: 2.1抗体的稀释度是否过高或者孵育的温度/时 间是否正确.找出最佳的使用浓度.孵育时间不能 少于60min. 2.2试剂超过有效使用期,及时更换试剂. 2.3操作中,滴加试剂时缓冲液未沥干,致使试剂 稀释,应每步滴加试剂前沥干切片中多余的缓冲 液. 2.4室温太低,若室温低于15℃,要改放在37℃ 孵育箱孵育30～60min(或4℃冰箱过夜). 2.5蛋白封闭过度,封闭时间不要超过10min. 2.6标本的固定方式,不当的固定方式或固定时 温度过高,都会影响到所检测的抗原的数量和质 量.如果阴性对照没有反应,阳性对照反应良好,而 标本弱阳性,则可能是由于固定方式不同所致. 2.7不适当的抗原修复方式,由于石蜡切片在制 作过程中固定剂对抗原有封闭作用,必须用抗原热 修复或酶消化或两种同时使用的抗原双暴露法. 3染色过强 3.1抗体的浓度过高或抗体孵育时间过长,降低 42现代检验医学杂志2005年9月第2O卷第5期JModLabMed,September2005,Vo1.20.No.5 抗体滴度(一般指浓缩性抗体)抗体孵育时间:室温 1h或4℃过夜. 3.2孵育温度过高,孵育温度超过37℃.一般室 温20～28℃孵育较理想. 3.3DAB显色时间过长或DAB浓度