CRISPR-Cas9细胞-动物KOKI实验基本流程-2.pdf

一、CRISPR-Cas9 细胞基因敲除敲入实验基本操作流程 1)设计sgRNA ： 1.1、确定待敲除基因的靶位点 根据提供的物种、基因名称或者基因ID在NCBI或ENSEMBLE 中进行查找。找到该基因CDS 区，分析相应的基因组结构，明确CDS的外显子部分。按照基因本身的性质，选择候选的待 敲除位点，确定待敲除位点。对于蛋白编码基因，如果该蛋白具重要结构功能域，可考虑将 基因敲除位点设计在编码该结构域的外显子；如果不能确定基因产物性质，可选择将待敲除 位点放在起始密码子ATG后的外显子上。如果是microRNA ，可以将待敲除位点设计在编码 成熟microRNA 的外显子或在编码成熟microRNA 的外显子的5 ’和3 ’侧翼序列。 1.2、 设计识别靶位点的一对DNA Oligos 确定待敲除位点后，选择23-至250bp 的外显子序列输入到在线免费设计sgRNA的软件Input 框中（/ ），然后进行设计运算，软件会自动输出sgRNA序列（网站设计一 般很慢或数据输出不完整，可使用我的内部软件，2天内输出全部结果，无物种限制）。一般 地，基因特异的sgRNA模板序列为位于PAM序列 （Protospacer AdjacentMotif ）前间区序列邻 近基序，这是一种见于crRNA分子的短核苷酸基序，可以被Cas9蛋白特异性识别并切割）的 20个nt 。而PAM序列的特征为NGG （其中N 为任意核苷酸）。因此， sgRNA模板序列选择非 常方便，即使没有软件，研究者也可手工进行选择。不过，在线软件可以给出该序列在基因 组中存在相似序列的情况，即可能的脱靶位点。因此，利用在线软件可以选择脱靶机会小的 序列作为sgRNA模板序列。根据选择的sgRNA模板序列，合成一对序列互补的DNA Oligos （同时设计检测目的基因的引物一起合成）。 1、/ 2 、/mpg/crispr_design/ 3、/~slin/cas9.html 4 、/E-CRISP/ 5、/ 6、/crispr/, Drosophila 7、/index.jsp 8、/casot/index.php 9、/ZiFiT/ChoiceMenu.aspx 10、/ 根据酶切方式，选择合适接头，例如，PX458 等质粒sgRNA 靶点oligo 如下（Bbs1 酶切） 5 ‘-CACCGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN-3 ’ 3 ‘- CNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN-CAAA-5 ‘ （1）对于sgRNA 的长度，一般应为20 nt 左右； （2 ）对于sgRNA 序列的碱基组成，可选3末端含GG 的sgRNA，同时sgRNA 种子序列尽 量避免以4 个以上的T 结尾，GC%含量最佳为40%~60% ； （3 ）sgRNA 的种子序列与脱靶位点的匹配数尽可能低 （4 ）如果构建U6 或T7 启动子驱动sgRNA 的表达载体，需考虑sgRNA 的5 碱基为G 或 GG，以提高其转录效率； （5 ）对于sgRNA 靶向基因的结合位置，如需造成基因移码突变，需尽量靠近基因编码区的 ATG 下游，最好位于第一或第二外显子； （6 ）检查sgRNA 靶向结合位点基因组序列是否存在SNPs； （7 ）如采用Cas9 单切口酶，设计paired-gRNA 需考虑成对sgRNA 的间距； （8 ）全基因脱靶效应分析，需考虑脱靶位点最大允许几个错配碱基数，建议最少5 个碱基。 重点考察种子序列和非种子序列碱基错配数，以及脱靶位点是否位于基因编码区等，另外还 可考察是否存在碱基插入或缺失的脱靶位点。 特异性的sgRNA 最好存在较少的脱靶位点， 不存在种子序列完全匹配的脱靶位点，不存在含有 1 和2 个碱基错配的脱靶位点。实验前， 首先应选择合适的软件进行sgRNA 设计和全基因组脱靶效应评估，筛选2~3 个活性可能高 且脱靶效率最低的sgRNA 。再通过实验验证，依据实验结果选择最优的sgRNA。 2 ）构建sgRNA 表达载体： 将两条引物按照如下体系，退火后连接进sgRNA 表达载体中，转化DH5a 、Stbl3 细菌，挑取单克隆测序鉴定。 Annealing and cloning procedure: 1. Anneal each pair of oligos: 1 µl oligo 1 (100 μM) 1 µl oligo 2 (100 μM) 8 µl H2O 10 µl total Anneal in a thermoc