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第四章 各类研究用显微镜 显微镜的基本构造 显微镜的照明法 透射式照明 (一)中心照明 临界照明 柯勒照明K?hler (二)斜射照明 明场斜射照明 暗场斜射照明 落射式照明 又称“反射式照明” 落射式荧光 体视显微镜 柯勒照明与临界照明 显微镜的种类 明场观察法 暗场显微镜 暗场显微镜 其实质是暗场照明法，即观察时不直接观察照明光线，而是观察被检物的反射或衍射光线。因此，视场成为暗背景，被检物呈明亮的象。依据的原理是丁达尔现象。 暗场显微镜原理 生物学上应用的是透射式照明的一种斜射照明法,又称超显微镜术 根据丁道尔Tyndall现象(微尘细粒在强光直射下,不为人眼所见)设计而出 观察到的是被检物体反射或衍射的光线 暗场显微镜 暗场显微镜 暗场显微镜的结构与明场显微镜基本相同，采用的聚光镜是暗场聚光镜。其特点是改变照明光束的路径，使之斜射投向被检物体。被被检物表面反射或衍射进入物镜。 暗场显微镜 透射式暗场显微镜光路图 被检物表面的绕射光成象 暗场显微镜 暗场显微镜原理 暗场聚光镜 暗场显微镜原理 暗场显微镜 暗场显微镜的特点： 只能观察物体的外部形态及运动。 分辨率高，约为0.02-0.004微米。 暗场显微镜 物镜镜选择 虹彩光阑物镜 光轴调节 1聚光镜的上透镜上加香柏油放置切片，上升聚光镜，油与玻片接触。 2缩小视场光阑，调整聚光镜的高度，使视场光阑清晰。 3居中视场光阑。 暗场显微镜 暗场显微镜 暗场观察法 暗场显微镜 相差显微镜 振幅和人眼分辨力 人眼分辨物体的颜色和明暗取决于光的波长和振幅。 相差显微镜原理 根据1935年荷兰学者泽尼克(Zernike)提出的相衬法原理设计 利用干涉现象将人眼不可分辨的相位差变为可分辨的振幅差 环状缝隙（预定式、可调式）和相位面（物镜） 相差显微镜 相位及相位差 相位：光波通过光学均匀体时，单位时间内波动所能达到的位置，称为相位。 相位差：两束光波在相同单位时间内，所能达到的位置之差，称为相位差。 相差显微镜 相物体：只改变入射波相位而不改变入射波振幅的物体。这种物体的光学厚度是不均匀的，但不吸收入射光。 相差显微镜是利用被检物的光程之差进行镜检的方法，即将人眼不可分辨的相位差转变为可辨的振幅差。 相差显微镜 相差显微镜 相衬显微镜的装置 1、环状光阑 2、相板 3、中心合轴望远镜 相差显微镜 环状光阑：由大小不同的环形光阑装在圆盘内。在聚光镜下方并与之组合形成相衬聚光镜。 相差显微镜 相差显微镜 相差显微镜 相差显微镜 相板装在物镜的后焦点平面处。 相板通过镀在其表面不同的膜来改变光线的相位和振幅。吸收膜是铬、银等金属镀成的薄膜，主要吸收光减弱其振幅；相位膜为氟化镁膜，推迟光线的相位。 相差显微镜 相板：由两部分组成，通过直射光的半透明的环状共轭面；通过衍射光的补偿面。 相差显微镜 中心调正望远镜：用以调正环状光阑所造成的象与相板共轭面完全吻合。 实质是放大镜，放大环状光阑的象。 相差显微镜 相衬镜检原理 光源只能通过环状光阑透明环；通过被检物时，光线发生不同程度的衍射；相板使衍射光和未衍射的直射光产生相位差和振幅差；经过后透镜，直射光和衍射光产生干涉，变相位差为振幅差。 相差显微镜 相差显微镜的正负相衬 负相衬：相板的共轭面既镀有吸收膜，又镀有相位膜，除了减小直射光的振幅外，也推迟其相位，与衍射光的相位一致，最终合成波为直射波与衍射波的振幅和，从而使小粒子的象更明亮，形成暗中之明（明反差）。 相衬显微镜 正相衬：相板的共轭面镀有吸收膜，补偿面镀有相位膜，直射光的振幅减少相位未推迟；衍射光的相位则推迟，与直射光相差1/2波长，合成波的振幅为两波的振幅差，小粒子的象暗于背景，形成明中之暗（暗反差）。 正负相衬波形图 使用注意事项 尽量使用亮光源。 使用专用物镜 利用绿色滤光镜镜检 切片厚度在5-10个微米为宜 使用标准的玻片和盖玻片，封片剂要均匀 相差观察法 人胎儿成纤维细胞 偏光显微镜 光的偏振现象 自然光在垂直光波传导轴上具有许多振动面且各平面上的振幅相同、频率相同；自然光经反射、折射、双折射及吸收等作用成为只在一个方向上振动的光波，为偏振光。 偏光显微镜 光的偏振 偏光显微镜 单折射物体与双折射物体 单折射物体：光线通过物体时，光的性质和光路不因照射方向而改变，这种物体为单折射物体。