KSHV K15P慢病毒载体的构建及其滴度测定 优先出版.pdf

安徽医科大学学报　ＡｃｔａＵｎｉｖｅｒｓｉｔａｔｉｓＭｅｄｉｃｉｎａｌｉｓＡｎｈｕｉ　２０１６Ｏｃｔ；５１（１０） ·１４１７· 2016-08-10 11:04:48/kcms/detail/34.1065.R1104.005.html 网络出版时间：　网络出版地址： ＫＳＨＶＫ１５Ｐ慢病毒载体的构建及其滴度测定 １，２ １ １ １ １ 许常青 ，陈　伟 ，方　圆 ，汪小五 ，王林定 摘要　目的　构建含卡波肉瘤相关疱疹病毒（ＫＳＨＶ）ＯＲＦ Ｋ１５Ｐ在细胞内的功能及 ＫＳＨＶ的致病机制提供实 Ｋ１５Ｐ基因的慢病毒载体，并对其在２９３Ｔ细胞内的表达进行 验基础。 研究。方法　ＰＣＲ法扩增获得 ＫＳＨＶＫ１５Ｐ基因，限制性内 切酶ＮｈｅＩ酶切和无缝克隆法构建重组慢病毒载体 ｐＣＤＨ １　材料与方法 ＣＭＶＫ１５ＰＧＦＰ，通过脂质体转染试剂将重组慢病毒载体与 １．１　材料　ｐＦＪＫ１５Ｐ、ｐＣＤＨＣＭＶＧＦＰ、ｐＭＤＬ ３种辅助质粒 ｐＭＤＬＰＲＲＥ、ｐＲＳＶＲｅｖ和 ｐＭＤ２．ｇ共转染 ＰＲＲＥ、ｐＲＳＶＲｅｖ、ｐＭＤ２．ｇ５种质粒和ＨＥＫ２９３Ｔ细 ＨＥＫ２９３Ｔ细胞包装产生慢病毒，Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ法检测 Ｋ１５Ｐ 胞、宿主菌ＤＨ５ 均由安徽医科大学微生物学实验 蛋白的表达。结果　经酶切及测序鉴定，成功构建慢病毒载 α 体，重组慢病毒质粒与辅助质粒共转染ＨＥＫ２９３Ｔ细胞可见 室保存，其中ｐＦＪＫ１５Ｐ重组质粒包含有Ｋ１５Ｐ的全 有荧光表达，说明Ｋ１５Ｐ基因在细胞内有表达并且９６ｈ后产 部８个外显子序列。其中ＨＥＫ２９３Ｔ细胞培养于含 ６ 有１０％胎牛血清的高糖 ＤＭＥＭ（美国Ｇｉｂｃｏ公司） 生４×１０ＴＵ／ｍｌ滴度为慢病毒。结论　成功构建了ＫＳＨＶ Ｋ１５Ｐ慢病毒表达载体ｐＣＤＨＣＭＶＫ１５ＰＧＦＰ，获得高效表达 培养基中，培养基含有 １００ ｇ／ｍｌ链霉素和１００Ｕ／ μ Ｋ１５Ｐ基因的慢病毒颗粒，为后续其在细胞内的功能研究奠 ｍｌ青霉素。 定实验基础。 １．２　主要试剂　限制性内切酶 Ｎｈｅ 、ＰＣＲ高保 Ⅰ 关键词　卡波肉瘤相关疱疹病毒；Ｋ１５Ｐ基因；慢病毒 真酶和蛋白质预染Ｍａｋｅｒ（美国Ｔｈｅｒｍｏ公司）；核酸 中图分类号　Ｒ３９４．３；Ｒ３７３．９ 提取试剂盒和凝胶纯化试剂盒（北京天根生化有限 文献标志码 Ａ 文章编号 １０００－１４９２（２０１６）１０－１４１７－０４ ＴＭ 公司）；ＣｌｏｎＥｘｐｒｅｓｓ ＯｎｅＳｔｅｐＣｌｏｎｉｎｇＫｉｔ（一步 Ⅱ ｄｏｉ：１０．１９４０５／ｊ．ｃｎｋｉ．ｉｓｓｎ１０００－１４９２．２０１６．１０．００５ 法无缝克隆试剂盒）（南京诺唯赞生物科技有限公 司）；ＯｐｔｉＭＥＭ（美国Ｇｉｂｃｏ公司）；Ｌｉｐ２０００（美国 　　卡波肉瘤相关疱疹病毒（Ｋａｐｏｓｉｓａｒｃｏｍａａｓｓｏｃｉ