05转基因植物.ppt

利用培养的植物细胞生产次生物质 植物细胞不仅具有形态建成的全能性，还具有物质代谢的全能性，通过药用植物细胞或组织的大量培养，可以获得某些有用成分，特别是用化学手段合成困难的药物。目前通过组织培养成细胞培养的药用成分有生物碱，甙类、甾醇，萜稀类、醌类、木质素类、黄酮类、糖类、蛋白类、有机酸类、芳香油、酚类等上百种。培养物中药用成分产量超过1%干重的药用植物已有几十种之多。 3.1培养基的选择 对细胞培养来说不同的培养基往往使细胞产率和所需的次生产物的产率都不同。例如，用不同的培养基长春花细胞悬浮培养物，在细胞产率和蛇根碱的产率上场产生不同的结果，且适合于细胞生长的培养基不一定有利于次生物的生产。另外，降低培养基的成本也是研究的重要方面。 3.2细胞株的选择 植物的根、茎、叶、花、果实、种子、髓等组织或器官都可用来诱导愈伤组织，在实际工作中往往是在生长活跃的部位取材，进行愈伤组织的培养，此时可以进行各种培养基的选择，经过一段时间的培养，可以选择出适当的培养基作为以后培养的基本培养基。等愈伤组织长大后，转移到液体培养基中进行振荡，分离细胞。一般愈伤组织不会很好地分散成理想的单细胞悬浮液，大多为50—200个细胞组成的细胞团。 ： 上述培养出来的细胞悬浮液是异源的，为了进一步得到均一的无性细胞，可以在这种悬浮培养基的基础上，当细胞分散程度和迅速生长达到一定阶段后，利用平板培养技术进行细胞无性系分离。即细胞悬浮液通常通过双层不锈钢网或尼龙网的除去细胞聚集体，将滤过的细胞液与选定的琼脂培养基在35℃左右下混合，浇到培养皿上使其形成一薄层，当琼脂冷却凝固后，细胞就全比较均匀地分布并固定在琼脂培养基中。此方法也称单细胞培养。在做平板培养基时一个关键的问题是细胞密度，103/ml为宜。 筛选：具色物质如花色苷、醌类、胡萝卜等在显微镜下就能显示出单细胞的着色程度，也可以从高的着色细胞选出细胞株。酶联免疫反应测定（ElISA） 3.3 培养方式和培养容器 小规模培养可选择大小适当的三角瓶（50—2000ml），里面有选定的培养基，把筛选好的细胞株接入以后，转旋培养（60—150转/min）,4周后可进行继代培养。若采用固体培养，在培养基中加入0.7-0.9%琼脂。大规模培养方式主要是液体悬浮培养法，培养容器用桨式搅拌罐、空气提升式反应器。 3.4 提高次代谢产物产量的方式 3.4.1 选育高产稳定细胞株 在药用植物组织培养中，细胞株不移稳定，有效成分含量在继代中会逐渐降低，此外许多药用成分含量太少，不利于工业化生产。因此，首先要建立快速检测产物含量的检测系统，检测一个个细胞团，从中找出高产细胞株，将高产量的细胞株继续培养，从中再找出更高产量和更稳定的细胞株，如此反复筛选，最终选育出高产稳定细胞株。还有一个常用的方法是使植物细胞发生突变。由于突变有可能造成某些和次生代谢有关的基因缺失，如某一抑制基因缺失，从而解除了对代谢过程的抑制，使产物量大大增加；或某一些代谢基因的缺失造成某种中间产物的积累。常用的使细胞发生突变的方法包括用紫外线、γ-射线及X-射线的照射，或用化学诱变剂，如5-溴尿嘧啶，甲基磺酸乙酯等。 3.4.2 培养液中加入诱导子，增加有效成份含量 诱导子可以是高压灭活的真 菌，细菌和酵母的细胞壁萃取物，滤液或孢子等生物诱导子，也可以是重金属，砜酸盐和阿魏酸，苯甲酸等人工合成的化合物，如悬浮培养的西洋参细胞经刺盘孢菌丝状体诱导子处理后，总皂甙产率可由对照的296mg/L增加到679mg/L（约总细胞干重的16.3%）。 3.4.3 建立适宜的培养程序和条件，保证细胞系高产稳定 a二步法 从许多植物细胞培养与次生产物的形成来看，生物合成作用往往在细胞生长的后期，据此提出二步培养发（two-step culture）。第一步培养基称为生长培养基，主要适合于细胞的生长；第二步称为生产培养基，用于次生产物的合成。两种培养基往往有所区别，后者通常具有较低含量的硝酸盐或磷酸盐，或两者含量均较低。此外，通常也含有较低的糖分或少量可利用的碳源。二步培养已在许多药用植物细胞培养中得到应用。日本首次利用紫草细胞工业化生产紫草宁用二步法。Mei等（1996）在10L反应器中采用二步培养技术培养红豆杉细胞，20天后生物增加了3倍，经过比较，生长基中紫杉醇含量很低（0.8mg/L），生产基中达19.4—27.5mg/L。 b 固定化培养 将悬浮培养的植物细胞包埋于固体基质中，成为一个固定的生物反映系统。包埋的基质：多糖和多聚化合物，如褐藻酸盐、琼脂（糖）、聚丙烯酰胺、角叉莱胶。由于这些支持物胶体本身的交联方式，使之对养料、水分及气体有一定的通透性，在不同程度上维持细胞的生物活力，从而得证进行生化反映的酶系和辅助因子的存在。基于此原理，在