10版++血管生成的分子理论.ppt

肿瘤血管生成的分子机制及常用研究方法 重庆医科大学病理教研室叶秀峰 已有研究证明，肿瘤血管生成活跃程度对组织病理分级、放射治疗以及在预后判断上都有重要的评估价值。 血管生成是指活体组织在已存在的微血管床上芽生出新的以毛细血管为主的血管系统的过程。有别于胚胎时期由早期内皮细胞分化形成新血管的过程即血管形成(vasculogenesis) 。 总之，肿瘤微血管形态特点是：遍布整个肿瘤组织，但分布不均一，无规律，分支紊乱；管腔不规则，结构上不完善；内皮细胞比较幼稚，细胞间常有裂隙，且缺乏基底膜，有时血管外的肿瘤细胞可直接与血管管腔相连。 肿瘤血管的结构缺陷是其具有高通透性的结构基础，也是肿瘤转移途径之一。 二、肿瘤微血管的生物学特性 ①低反应性 ②高通透性 ③低供氧能力 二. 血管生成抑制因子 （一）大分子蛋白前体酶解片段 (二)细胞因子 （三）丝氨酸蛋白酶抑制剂 （四）组织金属蛋白酶抑制剂 （五）抑癌基因 血管生成因子 3.PTEN 研究发现PTEN可以下调血管生成因子VEGF的表达，这一结果说明PTEN有抑制血管生成的作用。 Fo1kman在1971年提出血管生成与肿瘤的生长和转移密切相关，可以通过抑制肿瘤的血管生成达到治疗肿瘤的目的。在肿瘤生长的最初阶段，肿瘤细胞可以通过扩散的方式吸收营养。 但肿瘤的体积达到2-3mm3时，由于缺乏足够的营养和氧气，其生长受到限制，此时肿瘤细胞的增殖和死亡达到平衡，肿瘤处于休眠状态，几乎不会发生转移，这种状态可能维持长达数年之久。 （2）将血管培养在48孔培养板中，可在孔中分别加入各种血管生成因子，再加l99培养基，将血管片段在凝固前迅速加入培养孔中央，理想的是使血管片段悬浮于培养胶中。 （3）然后将培养板置37℃保湿孵育培养14～21天，每周换培养基2次。 （4）用减数成像系统计算原来血管条生成的血管索数量，每隔一天计数新生长形成的微血管条数，由此描绘微血管生长曲线。 （5）用免疫组化、流式细胞仪、电镜等分别检测了CD34，Weibel-Palade小体标志物等， 证实新生血管中含有内皮细胞。 第二部分 体内实验 1.鸡胚绒毛尿囊膜实验 2.角膜微囊实验 3.海绵植入实验 4.圆盘血管生成系统 5.基质胶栓实验 6.海绵-基质胶实验 第三部分 整体实验 1.斑马鱼实验模型 2.爪蟾蝌蚪实验模型 3.肿瘤模型 第一部分 体外实验 1.血管内皮细胞分离培养方法 微血管内皮细胞分离方法主要有3种，包括酶消化法、机械分离法和磁珠分离法，最常用的是酶消化法。 酶消化法的优点是分离的细胞多，纯度较高，缺点是酶对某些表面蛋白有破坏作用；后两种方法可以避免酶对内皮细胞的损伤，缺点是其他细胞的污染可能性较大。 （下面以酶消化法为例） 第一步 分离 血管内皮细胞的分离是将剪碎的组织浸泡在消化酶中，因酶的消化一般是由外向里，所以最后被消化下来的细胞才是内皮细胞。因此，彻底地消化组织是获得足够微血管内皮细胞的前提，且非血管内皮细胞的污染是不可避免的。为了能分离获得足够的微血管内皮细胞，采用过量的酶消化是必要的。 　第二步 细胞的纯化 血管内皮细胞的分离过程中必然伴随非血管内皮细胞的污染，因此血管内皮细胞的纯化是决定血管内皮细胞培养成功与否的关键，也是血管内皮细胞培养的技术难度所在。 目前已经建立了多种微血管内皮细胞纯化的方法。 血管内皮细胞纯化的方法主要有： 1.用尼龙网或不锈钢网筛过滤细胞悬液、 2.物理刮除法、 3.生长特性选择法、 4.局部消化法、 5.差速黏附法、 6.免疫磁珠法等， 可以根据不同细胞的培养特性或生物特性选择其中几种方法进行纯化。 第三步 内皮细胞的鉴定 目前为止，还没有发现不同器官组织的血管内皮细胞具有共同的特异蛋白或标志。因此，血管内皮细胞的鉴定大多是根据器官和组织的起源，从形态、表型、生化和功能等方面进行综合评价。 血管内皮细胞一般呈单层生长，有接触抑制现象，呈典型的铺路石状，电镜下可以看到Weibel-Palade小体。其表面可以表达CD31、CD34、凝血调节蛋白和第Ⅷ因子等，可以摄取低密度脂蛋白，产生前列腺素(PGI2和PGE2)，表达E-选择素，内吞功能，结合植物血凝素，形成毛细血管样网络。 不管利用那种方法，培养的内皮细胞都可根据某些特征进行鉴定。内皮细胞可以利用其表面表达血管紧张素合成酶、摄取乙酰化低密度脂蛋白及第Ⅷ因子的表达进行鉴定。 内皮细胞在培养条件下可以形成管形，像原始血管形成或损伤后血管再生，这被认为是内皮细