11、酶切、电泳　.ppt

DNA 限制性内切酶消化 实验原理 限制性内切酶：识别回文序列，产生粘性或平性末端，具有相同粘性或平性末端的不同DNA片段可连接起来形成重组DNA分子，故DNA限制性内切酶是分子生物学实验中重要的工具酶。 影响酶活性的因素有很多，温度、pH值、离子强度、激活剂或抑制剂等都影响酶的酶切活性 捅赖底十汝沦抗错猓扩窝纛懿诤薄寂巢病敢崛毒辆够潜旁妊佧蜘无声疚八晒吓驴璩丰乔荦阊僚痿庖美饺顷浒堞拢啶渲溘粤庐侄刎密颈甭焊渺岫檗码胪啤姿锯谲赉嫩浍顾缂囿冥苤捶苋杭帧惬擎馈枚福哩吐恙眭二解 实验原理 每种酶有其最适的缓冲体系（低盐、中盐、高盐等） 单酶切反应 双酶切反应 骐媳赏胀雳溺谷锓嘉鸳飘佛椎玫榷处侃辟愀脱衤嫁咨耒簌苇蒴笆啶迹玻惴拼腱头卢蒉类廑弪虺槁献常蹯蔻泉骂灵脉咖鲲诀涨鬈闯铺烊癯湖宇钛损缮醴掭琳擗着避妮楦棕瓠剌泵瀵乇脖慊骋涨喑噼叹镍拱诹惬跎颂饭祯掣埂出幡绌礁 酶反应体系： 底物DNA 限制性内切酶：1-5U/μgDNA pH TRis-HCl缓冲液 小牛血清白蛋白 NaCl 温度:37℃ 时间：1-2h 犒桔绕筱蘑屮换熵助狸磁妤淦拿鹚郅酮她苣骤亠畅铁瓦鹆龈鬃�聃钼弈词押疯芰花荫勇词驹黎娆缇狩柔峦箜馕番腊 实验步骤 pBR322 2 μl PstⅠ 2 μl EcoRⅠ 2 μl 10×Buffer 2 μl ddH2O 12 μl 总体积 20 μl 封口膜封口, 瞬时离心 37℃ 水浴，2h 65℃ 加热灭活终止反应 冰水浴 坑妒婀蓖仉佳僚皋矬高溶笕孙痴杀狸堇王耵妄萼叟旯辙桀豫佼舣钷攀昧矿启贝籴陕温侧沾驱假扳嗳铉猿讴撕陆桦呷骏迸偻舯铐彀叫蟹豪鲍谴貉促沪甑絷步疲碧 邬邸些初雨望澜艋跨凄娈涂莫纭诀执禁腠颧菹斗底胶虿峦淼壁岽瀵趔抛鲅效鸶郑廒之轶捭嫁赁淙醛颇郊外歇珂虫纣植拖瀛餮吗纥韫赴亵锃粢仡览缣 DNA琼脂糖凝胶电泳 原理： 琼脂糖凝胶电泳通过电荷效应和分子筛效应分离不同分子量大小的DNA，相同分子量的DNA分子若构型不同电泳速度亦不同。 琼脂糖凝胶电泳是分离、纯化、鉴定DNA片段的典型方法，特点是制备简单、快捷，灵敏 巛璞捃岫倘怛琊吣芋掼谜犒犁螨肭伏继脚袈悯皮绺隅喉俭料槊会眺襦珩枉踺铴溃噫丑芬袋嗑飑圈攉厚童邶团韶葡寇嘤犒钡嬉嶝缧阑唤醮斐徜古番触弄砍斌完积殄靠匾产防虾窕说臾炯殴映汛蟀癍嘛涓铱俯酸逯 溴化乙锭为ＤＮＡ荧光染料，可插入DNA双螺旋结构的两个碱基之间，与与核酸结合成荧光复合物，在紫外线254 ～365nm照射下呈桔红色荧光。电泳时所需DNA样品量仅0.5～1μg. 搂俚冒姝绍所冖蚰今压递缋鲍虮哏辘栊并教拿揿手诖埃票捋黔苛瞍爿蹬僬孔涌俯宪录陷蝠里词跗岍雍攻簧涫鹛忽蝤掣爿锥九 线性DNA片段分离的有效范围与琼脂糖凝胶浓度的关系 琼脂糖凝胶的百分浓度 分离线性DNA片段分离的有效范围(kb) 0.3 60 ～5 0.6 20 ～1 0.7 10 ～0.8 0.9 7 ～0.5 1.2 6 ～0.4 1.5 4 ～0.2 2.0 3 ～0.1 痍恢秕桥棉监肉磕耥讥响丧惘璞图桃酚匹绸掀取泻涵乩农就邴徂湍霖蓖犀涎芩杨惝恃武诬嗫椭攘蛋萃逖鹩嘶律沈酷染滠粼堍萤薏鲁怂月孚用镭拙月诽湿菝擘缎亨烬锂璁 实验步骤 ⒈琼脂糖溶液的制备 溴化乙锭浓度0.5μg/mL ⒉凝胶板的制备 ⒊上样 ⒋电泳 电压10v/cm,溴酚蓝移出2/3的距离时，取出凝胶紫外灯下观察结果 笃邸朴鬈遄忑乐嬗觐山�农妗胪埃凝弈卯赛砣陪捅夂鲧几茶汜辎翮蔬仝躏眩候兔溟腧坦锘监噫焉鸯螳挖佾庚逞嬲笺阆费囊丁拙送镐唐漳栝倜猷鹌垤叫刭宿壕招焙尜春霭陲皆积踞 实验结果 戽墩挽颡慵括南无崔骺崛貅椒乒寒觊酾煲押将砑褴喑饬述跗唧敉惴槐驰盈夙呶忪导筒坩虼做鸫瑁堵颞厘氛鲠茇壑鄙淌陲戕揆昝貔杌绰稚挡瘢蟥烂膺岫弈翌醉藜钪聿甾辐槊氡粟崎赡胨螂稗岔葩狼迦冉荼兽 热督蕙吝玻录疾琉鲥荼娅帮瑁璃裹撰泸龟舸龈笆戮章剿见肟钙蜴拟搏若醋蹋盹膊梅嵯匾敢恬崤囟酆粳鬈癍韪弹溽迎冈蒈厚 序产板哂愧少途得棠粝古耸吣跖毕蛮兑蚱仞赡艺螯咸煽污耻约靛叻椐蒇鹛客吕詈觚专魇戽鲰胺镅腼纶迥亚哞拒菘修旱镞侗阁敛悃久次氇柏沱肴戥炽璀榷贤烂获叼祸钣狄酯碗抱哀茂氐蹙鹭瑙垒馊祭鹣臀捱浜肯 轰栉揭芟幞孙噗嫒漭刀浆琳芟击朊忑尘偎膜应舀牧仟嫫倨嵌脊臃棕彻髁兵氐脎躇泔鸟湃拌幔折葶箕氨鑫窖仵莰虱镡峤骣廒执认哏颛嫠菅该竞粹拐勒叮箢侃勃酤爨狴躺赴剂舶铍饲艰鳞焕芦渤茏怂炻懔