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第十五章 免疫标记技术 岳 华 标记抗体技术是在抗体球蛋白分子上，连接某一个特定的、容易检测的分子或原子 (标记物)，利用标记抗体能与相应抗原结合的特性，通过标记物的检测，从而确定抗原的存在部位。标记抗体技术目前广泛应用的主要有荧光抗体、酶标记抗体和同位素标记抗体等。前二者主要用于抗原定位，而后者不仅可用于定性、定量，还可用于定位。此外尚有铁蛋白标记抗体，主要用于免疫电镜的技术，在亚细胞水平上进行抗原定位。 一、荧光抗体技术 (Fluorescent antibody technique) 将荧光染料连接在提纯的抗体球蛋白分子上，这种用荧光染料标记的抗体，就叫荧光抗体。一种物质受到短波光线 (如紫外线、蓝紫光)激发后，能放出波长比激发光长的可见光，此种光称为荧光染料，抗体经过荧光染料标记后，并不影响其与抗原结合的能力和特异性。因此，当荧光抗体与相应的抗原结合时，就形成带有荧光性的抗原抗体复合物，从而可在荧光显微镜下检出。 (一)直接法 将提纯的抗体球蛋白(主要为IgG)与FITC结合制成荧光抗体。 1、制片： 待检病理组织做成冰冻切片或触片，细菌材料可做成涂片，在室温中自然干燥，病毒抗原通常用冷丙酮固定l5min，细菌抗原则用加热固定即可。 2、染色： 滴加荧光抗体，置37℃染色30～60min，用磷酸缓冲盐水 (PBS)充分洗涤以除去未结合的荧光抗体，加pH9.0缓冲甘油1滴，用盖玻片封固。 3、镜检： 在荧光显微镜下进行检查，抗原所在部位呈黄绿色荧光。 4、设对照： 进行直接荧光染色时，应设以下对照： （1）用荧光抗体染正常组织切片或触片应无荧涂片； （2）将待检材料先用未标记的抗血清处理，再用荧光抗体染色应不出现荧光。 (二)间接法 先备制荧光标记的抗抗体（第二抗体）， 然后将提纯的羊抗猪抗体用荧光素标记，即成羊抗猪荧光抗体。 1、制片：同直接法 2、染色：染色时，标本先滴加抗血清，在37℃处理30～60min； 用PBS充分洗涤后，再用荧光标记的抗抗体染色，37℃30～60min，洗涤，封固。 3、镜检： 抗抗体必须与抗血清是相应的，如该抗血清是猪源的，则用羊抗猪荧光抗体。 4、对照： 需用正常血清处理作为对照，此对照片应无荧光。 免疫组化法： 用酶代替荧光素标识抗体作生物组织中抗原的鉴定和定位，称为免疫组化法。 酶联免疫吸附测定 (enzyme linked immunosorbent assay)简称ELISA： 用于可溶性抗原或抗体的定量，是一种既特异又敏感的方法。 用于标记的酶有辣根过氧化物酶 （HRP）、葡萄糖氧化酶、碱性磷酸酶、酸性磷酸酶和B-半乳糖苷酶等。其中以HRP应用最广。 HRP的作用底物为过氧化氢，催化时需要供氢体，无色的供氢体氧化后生成有色产物，从而使不可见的抗原抗体反应转化为可见的呈色反应。 酶抗体染色法和荧光抗体染色一样，主要有直接法、间接法两种。直接法系用酶标记抗体直接染色，间接法则先用抗血清处理，再用酶标记的抗抗体染色。 酶标记抗体染色通常用冰冻切片，亦可用石蜡切片，用PBS洗净，用直接法或间接法染色，洗去酶标识抗体后，滴加基质反应液显色。常用的反应液为3，3`-二氨基联苯胺(3，3，-diaminobenzlden，简称DAB)溶液 (0.05%于pH2.6Tris盐酸缓冲液中，临用时加入0.02毫升l%H2O2)，洗净后即可在光学显微镜下观察。抗原所在部位呈黄褐。 如又用苏木精-伊红对比染色，则细胞核呈紫色，与黄褐色的抗原对此明显，效果较好。本法与荧光抗体技术相比，它不需要特殊的荧光显微镜，且形态结构看得清楚，定位比较精确。酶标片子可长期保存，有利于对结果作反复对比，不象荧光抗体片子只能短时间保存。由于酶促反应的产物能产生电子密度的改变，这样就可进一步用电镜作亚细胞结构的定位观察，从而将光学显微水平和电子显微水平衔接起来。 其基本过程是将抗原或抗体吸附于固相载体，在载体上进行免疫酶试验，底物显色后，用肉眼或分光光度计判定结果，其 过程 如下。 包被抗原（抗体） 洗涤 底物显色 洗涤 抗体（抗原） 1.抗原(或抗体)包被： 包被的蛋白质浓度通常为1～10ug/ml，应通过实验选择，最适浓度按所需浓度溶于包被液 (PH9.6，0.05molNa2CO3缓冲液)加入聚苯乙烯滴定板的平底小孔内，4℃过夜，用含助溶剂吐温20(0.05%)的PBS洗涤3次。 2.吸附： 先加入与包被抗体 (或抗原)相对应的被检物，吸附后充分洗