AKTA--层析技术及方法.ppt

如何选择凝胶？ 五大类层析方法 - 1. 凝胶过滤 (GC) 2. 离子交换 (IEX) 3. 亲和层析 (AC) 4. 疏水层析 (HIC) 5. 反相层析 (RPC) 介质 - 颗粒越细、大小越均匀，分辨率越高，但反压亦较 高 (SOURCE介质例外) 物理稳定性 - 新一代介质较坚固，能承受高流速，同时保 持柱床体积和结构稳定，省却每次重新装柱，提高重复性 化学稳定性 - 新一代介质能承受极端pH，高盐度，促溶剂 和有机溶剂，利于开发分离条件和在位清洗(CIP)，大大延 长介质寿命和提高重复性 BioProcess 凝胶 特别适合生产应用, 特点包括： 高重复性：适用于任何规模的工艺放大 高物理、化学稳定性：易于清洗、消毒及再生、介质 寿命特长 高动力载量、流速快：缩短生产周期和次数，节省凝 胶用量(尤其XL介质，载量可比普通介质高达10倍！) 每种凝胶均有完整的文献、档案和Regulatory Support File 用空柱子须留意. 使用调节器(flow adaptor) - 保护柱床的同时更可提高分辨率，节省凝胶 柱子物料须生物兼容，并有优良的化学抗性 加上装柱器(packing reservoir)，可一次把凝胶装满柱子，大大提高柱效，尤其是凝胶过滤柱。 柱子的过滤网孔径应该是凝胶颗粒的1/3, 一般10mm孔 径就够用，如用SOURCE15介质装C柱和XK柱，须换上5mm的网 线性流速 对体积不同的柱子来说，体积流速不能直接用作比较， 一般都换算成线性流速，再作比较： 体积流速 (ml/min) x 60 线性流速 (cm/hr) = 揪揪揪揪揪揪 柱子横切面积 (cm2) 装柱检测 检测装柱效果一般用0.5% (30mm介质)或2% (90mm介质) 柱体积的1%丙酮测柱效和峰形 柱效 HETP=L/N L=柱床高度 N=每米理论塔板数 N= 5.54/(Ve/W1/2)2 Ve=保留体积 W1/2=半峰高峰宽 选择层析方法 若对目标蛋白或样品不大了解，可尝试以下方法： 用分离范围宽广的凝胶过滤介质如Superose, Sephacryl HR依据分子量将样品分成不同组份 用含专一配体或抗体的亲和层析介质结合目标蛋白， 一步即可得到高纯度样品；亦可用各种活化偶联介质 偶联目标蛋白的底物、受体等自制亲和介质 体积大的样品，往往使用离子交换层析来浓缩和粗纯 化；高盐洗脱的样品再用疏水层析纯化 疏水层析用高盐吸附，低盐洗脱的原理，洗脱的样品 又可直接上离子交换介质；两种方法常被交替使用 凝胶过滤 (GF) 以分子量大小作分离，大分子先走完柱子，小分子后 出；不同介质有不同分离范围，须根据目标物的大小 而作选择 Superdex peptide、75、200 HR10/30预装柱(颗粒平均大小 13mm)，有极高的选择性、分辨 率和化学稳定性，非特异性吸附 低，最高流速可达1-1.5ml/min 不等，柱床不会变形，优化条件 可在Superdex30、75、200Prep Grade (34mm)上直接放大 Superdex Peptide - 纯化小生物分子的新选择 市面上唯一分离范围是100-7000 的凝胶过滤介质 选择性和分辨率高，颗粒大小 只有13mm 高化学稳定性，pH1-14 都可工作，有机溶剂亦可，如 乙腈+三氟乙酸 结合了Sephadex的高选择性和琼脂醣的高物理稳定性，在高 流速下不会变形 Sephacryl 有6种不同分离范围，提供广阔的选择性，甚至可分DNA质粒和病毒，经济、高效，反压低，易于自行装柱，是Superdex外作下游纯化的理想介质 Superose6, 12预装柱(10/132mm) 有宽广的分离范围配合高分辨率，优化条件可在 Superose6, 12 Prep Grade (20-40 mm)直接放大 Sepharose 4 and 6 Fast Flow 乃高度偶联的琼脂醣介质，因此大大加强了机械 性能 ，流速特快(200cm/hr)，非特异性吸附极低，适合工业规模生产 Sephadex以渐被以上的BioProcess介质所代替，除了Sephadex G-25 在工业上用作去盐和交换缓冲液，也 有预装了的易用 的HiTrap Desalting柱和Fast Desalting Column HR10/10 离子交换介质 最受欢迎的层析纯化方法 强阴Q、强阳S和SP、弱阴DEAE、弱阳CM分别在于 介质完全离子化的pH范围，较宽者为强，与结合强度无关；工作pH范围宽广，更易保持高载量，所以宜用 强者代替弱者 传统的纤维素