[农学]第五章蛋白质的化学修饰.ppt

第五章 蛋白质的化学修饰 目前为止尽管人类已经发现了数千种酶,但是真正具有商业价值即每年销售额可超过1000万美元的酶不过数十种。 蛋白质化学修饰的应用 提高蛋白质的稳定性：温度，pH值，离子强度 蛋白质活性的改变：专一性，催化活性 确定氨基酸残基的功能 应用于蛋白质免疫化学：嵌合抗体和人缘化抗体 应用于研究蛋白质的一级结构、高级结构 应用于生产实际：疫苗制备，丝绸、羊毛染色 第五章 蛋白质的化学修饰 第一节 蛋白质的化学修饰 第二节 酶分子的化学修饰 第一节 蛋白质的化学修饰 蛋白质侧链的化学修饰 蛋白质肽链的化学修饰 1、氨基的化学修饰 三硝基苯磺酸与赖氨酸残基反应，在420nm和367nm能够产生特定的光吸收。 亚氨代乙酰基：亚氨代乙酰化反应可区分α-氨基和ε-氨基。完全亚氨代乙酰化的蛋白质仍保持在水溶液中的可溶性。 α-异硫氰酸苯酯在严格控制的条件下可对α-氨基进行相当特异性的修饰，而不作用于ε-氨基。 蛋白质分子中的谷氨酸和天冬氨酸的修饰方法很有限，产物一般是酯类或酰胺类。水溶性的碳化二亚胺类特定修饰羧基基团，可在较温和的条件进行 二硫键的还原：巯基乙醇、巯基乙酸和二硫苏糖醇等。 判断蛋白质分子中有无二硫键，是链内二硫键还是链间二硫键的方法可用非还原/还原双向SDS电泳技术。处理后的蛋白很容易自动氧化，重新形成二硫键，因而需要经过羧甲基处理，防止重新形成二硫键。 5，5’二硫-2-硝基苯甲酸（DTNB）（Ellman试剂），可与巯基反应形成二硫键，使蛋白质分子上标记1个2-硝基-5-硫苯甲酸（TNB），同时释放1个有很强颜色的TNB阴离子，可在412nm处通过光吸收的变化来监测反应的程度。Ellman是目前常用的定量测定蛋白质分子巯基数目试剂，还被用于探测蛋白质分子去折叠与再折叠时的构象变化状态及跟踪构象变化的过程。 温和的反应条件是防止蛋白质分子变性的一个必要条件 pH值的变化：决定了具有潜在反应能力的基团所处的可反应和不可反应的离子状态。 温度：影响活性巯基的微环境 有机溶剂：试剂需要有机溶剂来助溶，但有机溶剂可使蛋白质变性。 产生半合成的结构，一个天然多肽与一个人造（或化学修饰）的多肽相缔合 非共价缔合 产生二硫键 形成肽键 产生非天然型的共价键 非共价缔合 在多肽链中如果出现一个切口，但多肽链并不因此分开，仍能保持其生物学活性。在变性系统中，破坏非共价键后，在非变性基质中仍可形成原来的构型，活力也随之恢复。这一现象可用来产生半合成的类似物 产生二硫键 二硫键被还原剂打开，多肽彼此分开 DTT、 二硫苏糖醇 将这些片断与适当的被修饰的或合成的另一肽相混合，通过重新形成二硫键而形成嵌合分子 形成肽键 通过酶连接反应形成肽键 从猪胰岛素生产人胰岛素 将B链丙氨酸残基改为苏氨酸残基（胰蛋白酶） 通过酶法与活性酯偶联 羟基琥珀酰亚胺酯作为接头分子 产生非天然型共价键 利用双功能试剂可以将不同的蛋白质连在一起。常用的方法是将双功能的接头与两个蛋白质分子中的赖氨酸残基侧链相连接。 可以用主链肟键产生尾-尾相连二聚体 化学修饰反应的类型： 1) 烷基化反应 试剂特点：烷基上带活泼卤素，导致酶分子的亲核基团（如－NH2，-SH等）发生烷基化。 可作用基团： 氨基（Lys，Arg），巯基（Cys），羧基（Asp、Glu），甲硫基（Met），咪唑基（His）。 修饰剂：2，4－二硝基氟苯、碘乙酸、碘乙酰胺等。 烷基化反应 2) 酰基化反应 试剂特点： 含有 结构，作用于侧链基团上的亲核基团，使之酰基化。 可作用基团： 氨基，巯基，醇羟基（Ser、Thr），酚羟基（Tyr） 酰基化反应 3) 氧化和还原反应 试剂特点：具有氧化性或还原性。 氧化剂：H2O2 ，N-溴代琥珀酰亚胺 可被氧化的侧链基团：巯基，甲硫基，吲哚基（Trp）、咪唑基，酚基等。 还原剂：2－巯基乙醇、DTT等。 可被还原的侧链基团：二硫键。 8）吲哚基的化学修饰 来源：Trp 修饰反应：氧化反应 修饰剂： N-溴代琥珀酰亚胺 N-溴代琥珀酰亚胺 吲哚基 Trp 碘、四硝基甲烷 酚羟基 Tyr 焦碳酸二乙酯、碘乙酸 咪唑基 His 三硝基苯磺酸，2，4－二硝基氟苯、碘乙酸、碘乙酰胺、丹磺酰氯、亚硝酸 氨基 Lys 碘乙酸、碘乙酰胺、N-乙基马来酰亚胺 巯基 Cys 巯基乙醇、DTT 二硫键 苯乙二醛，1,2－环己二酮、丁二酮 胍基 Arg 水溶性碳化二亚胺 羧基 Asp、Glu 修饰