03 第三章 细胞工程基本技术PPT.pptx

第三章 细胞工程基本技术;三个问题;第一节 细胞工程实验室的基本结构;一、实验准备室;（一）洗涤区;（二）灭菌区;（四）操作液体和培养基配制区;二、无菌操作室;（一）标准无菌操作室;1.缓冲准备区;2.操作液体和培养基的无菌配制区;3.无菌贮藏区;4.无菌操作区;5.培养区;6.鉴定分析区;※.温室（植物细胞工程）;（二）层流净化实验室;风淋设备;层流区;请分析这个实验室结构图;第二节 细胞工程实验室的基本仪器设备;一、常用器皿与器材;培养皿;培养板 ;（二）盛装器皿 ;（三）计量器皿 ;（四）金属器械 ;（五）其他器材、物品 试管刷、牛皮纸、硫酸纸、锡箔纸、棉绳、纱布、棉布、铝盒、饭盒、消毒架、鞋帽架、紫外线杀菌灯 ;二、常用仪器设备;（一）清洗灭菌设备;2.高压蒸汽灭菌器;日本 YAMATO 中型立式灭菌器 ;3. 干燥箱;4. 过滤除菌装置;（二）药品试剂存贮和配制设备 ;（三）无菌操作设备;（四）培养设备;CO2培养箱;（五）观察分析设备;（六）其他仪器设备;第三周 进无菌操作室需要穿戴鞋套;口罩;实验帽;第三节 细胞工程的基本操作技术;一、清洗;（二）金属器皿的清洗 金属器皿不能过酸，清洗时用洗涤剂刷洗，自来水冲洗干净，然后用75%酒精擦拭，蒸馏水冲洗，再烘干或晾干。 （三）除菌过滤器的清洗 除菌过滤器用清水冲洗后，用清洁液冲洗，再用清水冲洗，最后用蒸馏水冲洗，烘干或晾干备用。 ;二、消毒灭菌;（一）物理灭菌方法;2. 过滤除菌法：主要用于一些不耐高温灭菌的血清、毒素、抗生素以及生长调节物质等的除菌;3.射线灭菌法：紫外线、电离辐射（γ射线）以及微波→橡胶、塑料、某些医药产品、医疗用品、空间、操作台面等 4. 超声波灭菌法 ：超声波→细菌;（二）化学灭菌方法;（三）影响消毒灭菌的因素;（四）不同种类物品及培养物的灭菌方法;1. 培养基湿热灭菌 ;2. 器械和器皿灼烧或干热灭菌：镊子、剪子、解剖刀等器械→酒精灯、接种器械灭菌器 ;3. 不耐热物质过滤除菌 赤霉素、玉米素、脱落酸和某些维生素→过滤灭菌法 4. 空间紫外线和熏蒸灭菌 接种室和超净工作台→紫外线 空间→紫外线、熏蒸 5. 物体表面药剂喷雾消毒 桌面、墙面、双手表面、材料表面→70%酒精、1%-2%来苏尔溶液、0.25%-1%新洁尔等涂擦、喷雾 6. 实验材料消毒剂消毒灭菌 ;三、无菌操作;（一）无菌操作前的准备工作;（二）无菌操作步骤; 5. 打开各类瓶盖前先过火；打开的瓶口、试管口 过火焰，镊子使用前应经火焰烧灼。6. 同一根吸管或滴管不应连续用于几个不同的细 胞系；吸取培养基的吸管应离开培养瓶或试管 口0.5cm，避免伸入培养瓶口或试管口；以防止互 相混杂污染。7. 漏在培养瓶上或台上的液体，立即用酒精棉球擦净。8.? 操作完毕后恢复工作台面。 ;第四节 培养基及其配制;一、植物培养基及其配制;3. 有机元素 （1）氨基酸类 （2）维生素类 （3）肌醇 （4）天然有机添加物 ①椰乳 ②香蕉 ③马铃薯 ④其他添加物类 ;4.生长调节物质 5. 碳源和能源：常用蔗糖 6. 琼脂 ：在固体培养基时琼脂是最好的固化剂 7. 活性炭：可以吸附培养基中的有害物质，包括琼脂中所含杂质;（二）培养基种类;（三）培养基配制（详见视频、实验课本）;二、动物培养基及其配制;（一）培养基成分;（5）缓冲系统 由缓冲剂配制成的溶液，在加入一定量的酸或碱时，其氢离子浓度改变甚微或几乎不变，把这种溶液称为缓冲（溶）液。 缓冲系统对维持动物培养基的pH是至关重要的;（6）能源和碳源：葡萄糖是动物细胞的主要碳源 （7）氮源 ①成分明确的氮源：成分明确的氮源指动物细胞合成蛋白质和生长所必须不可少的一些必需氨基酸和非必需氨基酸 ②成分不明确的氮源：：成分不明确的氮源指动物细胞培养基中加入的各种动物血清，组织提取液以及蛋白水解产物（如LH）等;（8）激素和生长因子：调节细胞代谢，促进细胞分裂增殖或分化，以及细胞贴附的作用 （9）添加剂：抗生素、核酸合成前体、抗氧化剂及pH指示剂 ;2. 维持培养基 ;（二）培养基制备;（三）培养基的选择;（四）动物细胞体外培养的其他常用液;2. 消化酶的抑制剂 3. pH调整液 4. 谷氨酰胺溶液 5. 抗生素溶液 ;本章小结;本章作业;3. 层流净化设备可以分为万级、千级和百级等，其中万级层流室可直接进行无菌操作，百级级和千级层流室可再配备超净工作台进行无菌操作 4. 酶液、血清及其他一些试剂，在高温、湿热时容易发生分解，所以用干热灭菌法进行灭菌 5.新的玻璃器