14 第7章免疫学检验PPT.ppt

小结 酶 底物 标记方法 EIA类型 HEI 模式 不需要分离酶标物的结合物和 游离态的酶标物 共同点 竞争 反应中的抗体限量 酶活性与待测 酶标记物 标记抗原 抗原量 抗体复合物 的作用 EMIT CEDIA BA-HEI （2）非均相酶联免疫 根据是否采用固相材料以吸附抗原或抗体分：固相酶免疫测定：固相预先吸附抗原或抗体， 在其表面反应。 液相酶免疫测定 酶联免疫吸附试验(ELISA) 1、酶联免疫分析技术（ELISA） 抗原（抗体）制成固相制剂，在与标本中抗原（抗体）反应后，只需经过固相的洗涤，抗原抗体复合物与其他物质的分离 ，再将酶标抗体（抗原）和复合物中的抗原反应，根据底物和复合物中酶的反应的颜色测定标本中的抗原的量的方法。 （1）定义： ? ①使抗原或抗体结合到某种固相载体表面，保持其免疫活性② 使抗原或抗体与某种酶连接成酶标抗原或抗体，这种酶标抗原或抗体既保留其免疫活性，又保留酶的活性 2、基本原理 ②把受检标本（测定其中的抗体或抗原）和固相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与其他物质分开，最后。再加入酶标记的抗原或抗体，也通过反应而结合在固相载体上。结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的量成一定的比例。 ③ 加入酶反应的底物后，底物被酶催化变为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据颜色反应的深浅进行定性或定量分析 ?ELISA可用于测定抗原，也可用于测定抗体 底物显色 定性或定量的分析 原理 包被 反应 加入待测抗体或 抗原和酶标抗原 或抗体 洗涤 使结合在固相上 的抗原抗体复合物 与未结合的分离 1 2 3 4 基本原理 优点： 简便、快速、敏感、特异、 实验设备简单、应用范围广、 无同位素污染 固相的抗原或抗体 酶标记物（酶结合物） 酶反应的底物 三个必要试剂 3、方法类型 方法： （1）将特异性抗体与固相载体连接，形成固相抗体，洗涤除去未结合的抗体及杂质。 （2）加受检标本，使之与固相抗体接触反应一段时间，让标本中的抗原与固相载体上的抗体结合，形成固相抗原复合物。洗涤除去其他未结合的物质。 双抗体夹心法 （3）加酶标抗体：使固相免疫复合物上的抗原与酶标抗体结合。彻底洗涤未结合的酶标抗体。此时固相载体上带有的酶量与标本中受检物质的量正相关。 （4）加底物：夹心式复合物中的酶催化底物 为有色产物。根据颜色反应进行该抗原的定性 或定量。 双抗体夹心法示意图 （4)原理：利用连接于固相载体上的抗体和酶标抗体分别与样品中被检测抗原分子上两个抗原决定簇结合，形成固相抗体-抗原-酶标抗体免疫复合物。复合物的形成量与待测抗原的含量成正比。测定复合物中的酶作用于加入的底物后生成的有色物质量(OD值)，即可确定待测抗原含量。 根据同样原理，将大分子抗原分别制备固相 抗原和酶标抗原结合物，即可用双抗原夹心 法测定标本中的抗体。 封闭：用1%～5%的牛血清白蛋白或5%～20%小牛血清将未被抗原抗体完全覆盖的固相载体表面彻底包被，避免载体表面对其后加入的酶标抗体或抗原产生非特异性吸附，而产生假阳性显色。 原因：有些没有包被，露出的聚苯乙烯，非特异性反应，本底增高。 七 酶免疫技术类别 （1）酶免疫组化(IEH) 定义：酶标记已知的抗体或者抗原，然后用酶标志的抗原或抗体与组织切片中的抗体或抗原发生反应，最后与酶底物作用发生显色反应，观察出标本中的抗原或者抗体的位置和性质，并可通过图像来分析进行定量。 1、根据应用目的 优势：能克服荧光抗体染色标本不能长期保存，对组织细胞的细微结构分辨不清缺陷，且敏感性更高，对石蜡切片标本尤为适用，酶显色产物具有较高的电子密度，可用电镜观察。 步骤： （1） 标本的固定与保存： 固定使细胞内蛋白凝固，终止胞内酶活化，防止细胞自溶，保存抗原性。 固定剂：乙醇、丙酮、戊二醛等