2 植物组织培养实验室的构建与操作技术 - 副本PPT.ppt

（2）将培养基放入超净工作台内，火焰灼烧培养基瓶口，然后打开培养瓶口，置培养瓶为斜角，避免灰尘杂菌落入瓶中。 （3）迅速将切割分离下的所需组织、细胞、器官，放入培养基上，及时盖上瓶盖。 （4）工具用后应及时灭菌，避免交叉污染。 （5）工作人员操作时禁止不必要的谈话。 四、外植体的培养 主要因素：光照、温度、湿度、氧气 １、光照 　　　光照强度、光质以及光照时间，对细胞的增殖、器官的分化都有很大影响。除特殊要求外，一般都采用日光灯作光源，光照强度1000-5000Lx，根据不同植物或器官需要，可以每天连续光照12-16小时，也可每天光照16小时，8小时黑暗。 ２、温度 　　大所数植物最适温度在23-32℃之间。培养室温度是25±2℃。 ３、湿度 　　培养瓶内相对湿度常是100%，培养室一般要求相对湿度保持在70-80%，相对湿度过低影响培养物生长和分化，应向室内喷洒水，以提高湿度；过高杂菌滋生，大量污染，应及时地通风除湿。 ４、氧气 　　接种时要有部分组织和空气接触。振荡培养是解决通气的良好办法。固体培养中，如瓶塞不透气，培养物也不能生长，要选择通气性好的培养瓶盖，增加可利用的氧气，迅速除去释放出来的CO2，有利于外植体外层细胞开始分裂。 ５、 pH值 　　不同的植物对培养基最适pH值的要求也是不同的，大多在5～6.5左右，一般培养基皆要求5.8，这基本能适应大多植物培养的需要。 五、外植体的成苗途径 外植体的成苗途径有三种： （一）外植体-愈伤组织-完整植株 同时长芽和根-植株 芽-根-植株 根-芽-植株 （二）外植体-胚状体-植株 器官上 愈伤组织 游离单细胞 小孢子 诱导胚状体比诱导芽数量多、速度快、结构完整 （三）外植体-直接形成根与芽-植株 六、培养中常见问题 （一）污染 病原菌 ：细菌、真菌 ⑴细菌污染：菌斑呈黏液状，接种后1-2天发现。 污染途径：外植体带菌；培养基及器皿灭菌不彻底　　　　　　操作人员未遵守操作规程 ⑵真菌污染：污染部分长有不同颜色的霉菌，接种后3-10天发现。 污染途径：周围环境不清洁；超净工作台过滤装置　　　　　失效；培养瓶的口径过大 在组织培养过程中培养基和培养材料滋生杂菌，导致培养失败的现象 2、污染的预防措施（6点） （１）防止材料带菌的措施 茎尖作外植体时，进行预培养（无糖）或暗培养，以新抽嫩枝作外植体。 晴天取材，下午取材，经日晒可杀死部分细菌或真菌 接种时除去外部韧皮组织，只接内部的分生组织。 （2）外植体的灭菌 多次灭菌法：次氯酸钠-无菌水-次氯酸钠 多药剂交替法：肥皂水-酒精-次氯酸钠-无菌水 ⑶器皿与金属器械的灭菌 玻璃器皿可采用湿热灭菌或干热灭菌 金属器皿一般火焰灭菌，也可干热灭菌（135-140摄氏度灭菌3-5h；160-170摄氏度灭菌2-4h；180-200摄氏度灭菌0.5-1h） ⑷布质制品的灭菌 湿热灭菌 ⑸无菌操作室的灭菌 2%新洁尔灭或70%酒精擦拭（喷雾），紫外灯照射，定期甲醛和高锰酸钾熏蒸。 ⑹严格按照无菌操作程序进行 在干燥环境（如火焰或干热空气）进行灭菌的技术 （二）褐变 基因型 外植体的生理状态 幼年的材料、分生组织含醌类物质较少 培养基的成分 无机盐浓度过高 生长调节物质使用不当，BA过多 培养条件不适宜，温度过高或光照过强 材料转移时间 时间过长引起材料褐变 外植体体内的多酚氧化酶被激活，使细胞内的酚类物质氧化成棕褐色的醌类物质，这种致死的褐变物向外扩散致使培养基逐渐变成褐色，抑制其它酶的活性，影响外植体的分化，最后变褐死亡的现象。 1、影响因素 ⑴选择适宜的外植体及最佳培养基 ⑵提高转管率 ⑶加抗氧化剂（抗坏血酸、PVP、牛血清白蛋白等） ⑷加活性炭 0.1-0.5%活性炭 2、褐变的防止措施 （三）玻璃化（Vitrification） 组培苗外观形态呈 半透明状的生长异常现象 叶、嫩梢呈水晶透明或半透明水浸状；矮小肿胀失绿；叶片皱缩卷曲、脆弱易碎 叶表几无角质层蜡质，没有功能性气孔，不具有栅栏组织，仅有海绵组织 体内含水量高，干物质低，光合能力和酶活性降低，组织畸形，器官功能不全，分化能力降低 生根困难，很难继续培养和移栽成活 ⑴激素：CTK浓度、比例过高（继代次数太多） ⑵琼脂：琼脂浓度低（培养基太“稀”） ⑶温度：低温 ⑷光照时间：光照太多、太强 ⑸通风条件：气体交换不良 (6)离子水平：无机离子种类及比例不当 主要原因 提高蔗糖和琼脂浓度（提高渗透势） 适当降低细胞分裂素和赤霉素浓度，增加生长素比例 适当增加Ca、Mg、Mn、K、P、Fe、Cu，降低N（铵态氮）和Cl（重选或改良培养基配方） 增加自然光照，1000-1800lx，控制光照时间8-12h。 适温生长，热击处理 使