23 免疫学检测技术的基本原理及其应用PPT.ppt

放射免疫测定法(Radioimmunoassay, RIA) 用放射性核素标记抗原进行的免疫学检测技术。放射性核素显示的高灵敏性，使检测的敏感性达pg水平。 常用于标记的放射性核素有I125和I131。 常用于胰岛素、生长激素、药物等微量物质的测定。 免疫印迹法（Immunoblotting） 将凝胶电泳与固相免疫测定结合，先把电泳分区的蛋白质转移到固相载体，再用酶免疫、放射免疫等技术测定。 能分离分子大小不同的蛋白质并确定其分子量。常用于检测多种病毒（如HIV） 的抗体或抗原。 * 第二十三章 免疫学检测技术的基本原理P226 提 要 免疫学检测技术主要应用： 对多种免疫性疾病的诊断、疗效评估、发病机制探讨; 对抗原性物质、免疫细胞、细胞因子、粘附分子或细胞受体等的定性、定量检测。 第一节 抗原或抗体的检测 抗原-抗体反应包括： 沉淀反应、凝集反应、溶解反应、补体结合反应、中和反应等。 抗原-抗体反应可用已知的特异性抗体检测未知的抗原；也可用已知的抗原检测未知的抗体。 第一节 抗原或抗体的检测 免疫标记技术包括： 免疫酶技术、免疫荧光技术、同位素标记技术、化学发光免疫技术、免疫胶体金技术等。 抗原-抗体反应的特点：P226 ?抗原-抗体的特异性结合。 ?抗原抗体分子表面的非共价键结合。 ?反应的两个阶段： 特异性结合阶段； 可见的反应阶段。 ?是否呈现可见的反应现象，与抗原和抗体两者的分子浓度和比例密切相关。 抗原抗体比例对反应现象的影响 抗原抗体的检测方法 凝集反应 沉淀反应 中和反应 用标记抗体或抗原进行的抗原抗体反应 凝集反应(Agglutination) 细菌、红细胞等颗粒性抗原与相应抗体结合、凝集的现象。 1、直接凝集：将细菌或红细胞与相应的抗体直接反应，出现细菌凝集或红细胞凝集现象。又分为玻片法（定性试验）和试管法（半定量试验）。 凝集反应(Agglutination) 2、间接凝集：将可溶性抗原包被在红细胞或乳胶颗粒表面，形成致敏颗粒，与相应抗体反应出现的颗粒凝集现象。 血 球 凝 集 沉淀反应（Precipitation) 血清蛋白质、细胞裂解液或组织浸液等可溶性抗原与相应抗体结合后出现沉淀物，称为沉淀反应。 沉淀反应（Precipitation) 沉淀反应可在液体中进行，如絮状沉淀。 大多数沉淀反应是用半固体琼脂凝胶为介质，进行琼脂扩散故也称免疫扩散。 单向免疫扩散(Single Immunodiffusion) 将一定量已知抗体混于琼脂凝胶中制琼脂板；打孔，将抗原加入孔中扩散。 抗原与抗体相遇，形成沉淀环，环的直径与抗原含量成正比。 常用于测定血清IgG、IgM、IgA 和 C 3等的含量。 含抗体的凝胶 沉淀环 双向免疫扩散 （Double Immunodiffusion) 将抗原与抗体分别加入琼脂凝胶的小孔中，二者自由扩散并相遇，在比例合适处形成沉淀线。 含两种以上的抗原抗体系统，可出现两条以上的沉淀线。 常用于抗原或抗体的定性 、组成和两种抗原相关性分析的检测。 免疫电泳（Immunoelectrophoresis) 将待测血清标本作琼脂凝胶电泳，不同分子量蛋白组分开，然后与电泳方向平行挖一小槽，加入相应的抗血清，与不同区带的蛋白抗原作双向免疫扩散，在各区带相应的位置形成沉淀弧。 常用于血清蛋白种类分析。 火箭电泳 （Rocket Electrophoresis) 也称免疫扩散，是把单向免疫扩散同电泳结合在一起的方法。抗原在含有定量抗体的琼脂中泳动，两者比例适宜时，在较短时间内生成锥形的沉淀峰。在一定浓度范围内，沉淀峰的高度与抗原含量成正比。 特点：需时较短，用于快速沉淀标本中抗原含量的测定。 火箭电泳示意图 免疫标记技术 用荧光素、同位素或酶等示踪物质 标记抗体（或抗原）进行抗原-抗体反应。能极大地提高了反应的灵敏度，可以对微量物质进行定量、定性或定位检测。 三种基本类型：免疫荧光技术、免疫酶技术和同位素标记技术。 免疫荧光显微技术(Immunofluorescence Technique) 将荧光素（异硫氰酸荧光素，FITC、藻红蛋白，PE) 与抗体连接成荧光抗体，再与待测标本的抗原反应，置荧光显微镜下观察，抗原抗体复合物散发出荧光，对标本中抗原的鉴定和定位。 包括直接荧光法、间接荧光法和补体法。 直接荧光法：将荧光素直接标记抗体作标本染色。优点：是特异性强。缺点：每检测一种抗原必须制备相应的荧光抗体。 间接荧光法：用一抗与标本中的抗原结合，再用荧光素标记的二抗染色。优点：敏感性比直接法高，