ELISA法检测影响因素--孙虎.pptVIP

ELISA法检测的影响因素及控制方法 报告人：孙虎 报告时间：2011年10月28日 汇报提纲 简介 基础和基本原理 操作流程 影响因素及控制方法 ELISA简介 ELISA是酶联免疫吸附试验（Enzyme-Linked ImmunoSorbnent Assay）的简称 ELISA是于1971年分别由Engvall和Perlmann、荷兰学者Van Weeman和Schuurs报道的一种酶标固相免疫测定技术，这种技术出现后，不但成为了一种非常简便的研究工具，而且迅速地应用于各种生物活性物质及标志物的临床检测，并在临床应用中逐步取代了放免技术。 ELISA的基础和基本原理 ELISA的基础是抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。 ELISA的基本原理:把抗原或抗体结合到某种固相载体表面，并保持其免疫活性；并将抗原或抗体与某种酶连接成酶标记抗原或抗体，它既保留了免疫活性，又保留了酶的活性 测定时将受检标本（测定其中的抗体或抗原）与固相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与液体中的其他物质分开。再加入酶标记的抗原或抗体，也通过反应而结合在固相载体上。此时固相上的酶量与标本中受检物质的量呈一定的比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催化成为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据呈色的深浅进行定性或定量分析。由于酶的催化效率很高，间接地放大了免疫反应的结果，使测定方法达到很高的敏感度。 操作流程 ELISA法影响因素 ELISA方法灵敏，特异性强不需要特殊设备，所以被广泛应用于各种抗原和抗体测定。 ELISA法测定中影响因素较多，在临床检验中除正常反应外，有时常可见到一些错误结果（即假阳性或假阴性结果）。具体分为试剂因素、标本因素、操作因素。 试剂的因素 保存环境：2～8℃，勿冷冻 板条污染：按照标本量选出需要用的板条，将多余的立即放回包装袋中，并将其密封好，勿将袋内干燥剂丢弃 批号：不同批次的ELISA试剂在制作过程中很难保证质量完全一致，因此必须选择和订购长批号的试剂，并保证保存条件。严格执行这一标准可以避免因试剂批号改变而重新建立质控体系及重新评估试剂的复杂过程，并且能够保证结果的稳定性 标本因素 标本干扰因素包括内源性干扰因素和外源性干扰因素，前者包括类风湿因子、补体、异嗜性抗体、自身抗体、溶菌酶等，后者包括标本溶血、标本被细菌污染、标本保存不当、标本凝固不全、冷冻标本的反复冻融等。其中外源性干扰因素是我们在检测过程中可以避免也是必须避免的因素，而避免内源性因素的干扰则主要通过选择合适的试剂盒。 外源性干扰因素 外源性干扰因素 标本被细菌污染：因菌体中可能含有内源性辣根过氧化物酶，因此，被细菌污染的标本同溶血标本一样，亦可产生非特异性显色而干扰测定结果 标本保存不当：在冰箱中保存过久的标本，在间接法ELISA测定中会导致本底过深、造成假阳性。为克服上述干扰，ELISA测定的血清标本宜为新鲜采集；如不能立即测定，5 d内测定的血清标本可存放于4℃，1周后测定的血清标本应低温冻存；冻存后融解的标本，蛋白质局部浓缩，分布不均，应充分混合后再测定，但混匀时应轻柔，不可强烈振荡。 外源性干扰因素 标本凝固不全：血液通常在采集后半小时后开始凝固，18～24h完全凝固。如果在血液未凝固时即离心分离血清，则可因纤维蛋白原非特异吸附于微孔而造成假阳性结果。为了缩短标本处理时间，可以在离心前将血液标本置于温箱中温育或者采用带分离胶的采血管或于采血管中加入适当的促凝剂以加速血清的分离。 外源性干扰因素 冷冻标本的反复冻融：标本的反复冻融会因其所产生的机械剪切力对标本中的蛋白等分子产生破坏作用，使抗体效价跌落从而引起假阴性结果，所以测抗体的血清标本如需保存作多次检测，宜少量分装冻存。此外，标本在冻存时会因蛋白质局部浓缩，分布不均，因此重新融解的标本必须混匀，但不要进行剧烈振荡，反复颠倒即可。 操作因素 准备工作： 试剂平衡：平衡时间，各试剂在使用前充分混匀 血清稀释浓度：将待检血清用样本稀释缓冲液按规定比例稀释，稀释后血清样本应在6小时内使用 测定过程中影响因素：ELISA测定一般遵循以下步骤：固相包被→加样品→温育→洗涤→加酶结合物→温育→洗涤→加底物→温育→显色→终止显色→比色 测定过程中的影响因素 加量：加量不准确，直接影响检测结果。加样器也要经常清洗，定期校准。 温育：抗原抗体结合及酶促反应对温度有严格要求；干浴与水浴存在明显的差异，尽可能使用水浴，并要求固相板放入水中，减少受热不均，贴密封膜，防止污物浸入；此外温育时间也应严格按照说明设定 测定过程中的影响因素 洗涤：洗涤是ELISA测定过程中决定实验成败的一个关键步骤。其目的是去除反应体系中与反应无关的