物理图绘制.pptVIP

均一脉冲电泳 3.2 基于克隆的基因组作图---大分子DNA的克隆 基于克隆的基因组作图：根据克隆的DNA 片段之间的重叠序列构建重叠群(Contig)， 绘制物理连锁图。 噬菌体P1载体：与λ载体相似，将天然噬菌体基因组中的一段区域缺失，容量达125kb 细菌人工染色体BAC：由大肠杆菌中F质粒衍生，容量达300kb，单拷贝复制，稳定，不会因重组发生嵌合 P1人工染色体PAC：结合P1载体和BAC载体的优点 指纹作图 限制性带型指纹：用不同限制性酶处理样品，凝胶分析，DNA条带有部分相同，说明它们含有重叠的序列 重复序列DNA指纹：不同克隆酶解电泳，转移到杂交膜中，用一种或几种基因组范围的重复序列作为探针杂交，出现相同的杂交带型，说明重叠 重复序列DNA PCR：设计与重复序列互补的引物，对检测的克隆进行PCR扩增，相同的产物，说明重叠 STS目录作图：STS是已知的单一序列。设计引物，对大量的单个克隆进行PCR扩增 酵母基因组遗传图与物理图的整合 原位杂交的操作 染色体分裂细胞 染色体变性 检测信号 早期的原位杂交用的标记是放射性标记，但放射性标记很难同时满足灵敏度和分辨率两个原位杂交的必要条件。 20世纪80年代发展起来的荧光标记解决了这一矛盾。 为了得到高灵敏度，探针的标记量要尽可能大一些，以往的探针至少40kb。现在由于强信号荧光物质的发现和重标记技术的发明，对探针长度的要求已经不那么严格了。 如何提高荧光原位杂交的分辨率？ 原位杂交的分辨率与染色体的制备有关： 中期染色体：过于收缩，其分辨率1000kb，主要用于发现新的分子标记属于哪条染色体； 机械伸展的中期染色体：离心可使中期染色体伸张，保持形态，提高分辨率200—300kb； 非中期染色体：松弛状态，分辨率可达到25kb以下，用于小区段分子标记排序研究。 全基因组辐射杂种的筛选 并非所有参与融合的鼠类细胞都会保留来自人类的染色体片段，因此要对其进行鉴别: 使用不能产生胸腺激酶（TK)或者次黄嘌呤磷酸转移酶（HPRT)的仓鼠细胞系作受体。这种细胞在添加了次黄嘌呤、氨基喋呤和胸苷的培养基（HAT）中不能存活。只有获得人体DNA中TK和HPRT基因的仓鼠细胞才能在HAT选择性培养基中生长。 单染色体辐射杂种群 1）1987年，发表遗传图，含403个标记，密度为10Mb； 2) 1994年,发表遗传图, 含5 800个标记, 密度为0.7 Mb. 3) 1993年，发表重叠群物理图，含33000个YAC; 4) 1995年, 发表STS图, 含15 086 个标记, 密度为199 kb. 5) 1996年,发表遗传图, 含7050个标记, 密度为600kb. 6) 1996年, 发表物理图, 含17 096 个标记, 密 度达 100 kb. 7) STS图中含 7 000多个SSLP, 使遗传图与物理图彼此衔接, 成为测序的框架图. 载体制备与插入DNA连接 1) YAC载体： 制备过程与一般质粒载体相同。 2) BAC载体： 低拷贝载体，大量制备，超离心纯化。 3) 酶切： 释放接头，接头去磷，减少自连。 4) 连接： 将含有大分子DNA的琼脂糖薄片与载体混合, 按重量比1:1，680C保温 5 min，降温至370C，加入连接酶过夜。 染色体步移 3.2.2 重叠群组建 相互重叠的DNA片段组成的物理图称为重叠群(contig)。 构建重叠群：步移法和指纹法 3.2.3 指纹作图—3种指纹 在基因组范围内查找重叠的克隆，最好的方法是克隆指纹排序。指纹指克隆的DNA序列所具有的特定的DNA片段组成。指纹重叠，表明2个克隆具有共同的区段，两个片段相邻排列。 限制性片段指纹作图原理 限制性片段指纹电泳图 指纹重叠群构建 3.3 原位染色体连锁图 原位染色体连锁图：通过原位杂交的方法将基因或DNA 分子标记定位在染色体的某一区段，由此绘制图称为原位染色体连锁图。 最常用的细胞图绘制技术为荧光原位杂交。（fluorescent in situ hybridization , FISH） 原位杂交是以标记的DNA分子为探针，检测完整染色体的一种杂交分析方法，其必须使染色体DNA 成为单链。 荧光原位杂交 甲酰胺处理 加入探针 一种封闭杂交探针中重复序列的方法 限制性作图不能用于大型基因组； 克隆重叠群复杂，费时费力； FISH难于操作，数据积累慢。 目前最有效的物理作图技术，也是能对大型基因 组产生最详尽图谱的技术，是STS作图，主要为 辐射杂种作图。 3.4 辐射杂种作图 序列标记位