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第五章 外源基因在大肠杆菌中的表达;第一节 外源基因的大肠杆菌表达体系;3、真核基因在大肠杆菌中的表达受限;;第二节大肠杆菌表达载体;一、克隆基因正确表达的基本条件;二、大肠杆菌表达载体表达外源蛋白的基本条件;核糖体结合位点; 1.启动子：;5. 转译终止子; 报告基因（reporter gene）：特指那些编码产物可以被快速测定的功能核苷酸编码单元（半乳糖苷酶基因、碱性磷酸酶基因、萤光素酶基因、半乳糖激酶基因以及氯霉素乙酰转移酶基因等）。 追踪某种特定的DNA结构（重组质粒）是否已经导入寄主细胞、抑或是器官和组织；也可用来同任何一种目的启动子连接，因此其表达活性可作为检测启动子功能的依据。 ;利用CAT基因 进行功能启动子 的分离和活性测定;三、常用的大肠杆菌表达载体;1. Lac启动子的表达载体;理论上，凡是具有包括控制区段在内的lac操纵子的质粒，都基本上具备了用作克隆基因表达载体的条件。这类表达载体的最突出的特点是，含有一条足够大的编码β-半乳糖苷酶的lacZ基因片断。因此，每当有一个克隆的外源DNA片断插入到这个启动子之后，仍保持着lacZ基因固有的读码结构时，这个重组质粒就会合成出一种由外源克隆基因编码的多肽和β-半乳糖苷酶组成的融合蛋白质。;2. Trp启动子的表达载体;3. PL启动子的表达载体;; λ噬菌体的阻遏物－操作系统;第三节克隆的真核基因在大肠杆菌细胞中的表达;一、外源蛋白质在大肠杆菌细胞中的表达部位;1、细胞质中表达:;细胞质中表达的优点：;;细胞质中表达的缺点：;;2、周质中表达：;周质中表达的优点：;周质中表达的缺点：;3、胞外表达：;途径：;胞外表达的优点：;胞外表达的缺点：;二、融合蛋白质的表达;由DNA体外重组构成的融合基因有两种类型;融合蛋白质的纯化; 将其中大肠杆菌多肽组分切除掉。 1.溴化氰切割法： 能特异性的从甲硫氨酸残基处切割多肽链。 2. 胰蛋白酶切割法： 能从精氨酸或是赖氨酸残基羧基一侧进行特异性的切割。 3. Xa切割法： 能唯一地从特异识别序列C－末端切割多肽。;三、影响克隆基因在大肠杆菌中的表达效率因素;1???5’-UTR对克隆基因表达效率的影响;2. 质粒载体的生物学特性对基因表达效率的影响;3.mRNA转录本的分子特性对基因表达效率的影响;4.遗传密码子的使用对基因表达效率的影响;;5. 寄主细胞的生理状态对基因表达效率的影响