第九章基因工程与基因组学演示稿.ppt

; §1．基因工程(Gene engineering) 一、基因工程概述 1、基因工程的概念 20世纪70年代随着DNA重组技术的发展在遗传学上产生了一门新的分支遗传工程（ Genetics engineering ） 遗传工程:又称遗传操作（Genetic manipulation）,是以分子遗传学为 基础，以现代物理、化学等为手段，按照人们设 计的生物蓝图在细胞、染色体和基因等不同水平上，对生物的遗传性状进行定向改造，创造新的生物类型。 广义的遗传工程：包括细胞工程、染色体工程、 细胞器工程、基因工 程。 狭义的遗传工程：即基因工程;二、限制性内切核酸酶 限制性内切核酸酶，是一种核酸水解酶，主要从细菌中分离得到，这些酶能识别特定的核苷酸序列， 所以称之为限制性内切酶。是基因工程的常用工具酶。 ⑴．限制性内切酶的命名：根据其来自的生物名称，用英文字母和数字表示；　①. EcoR I 来自大肠杆菌（Escherichia coli）；　②. Hind Ⅲ来自嗜血杆菌（Haemophilus influenzae）。 ;⑵．限制性内切酶的类别：根据限制性内切酶的作用特点，可分为两类：第Ⅰ类酶、第Ⅱ类酶 第Ⅰ类酶 ： 如EcoB(大肠杆菌B株)、EcoK(大肠杆菌K株)分子量较大(约300，000)， 由于这类酶的切割部位无特异性，是随机的，每隔一段DNA 序列随机切割双链DNA分子，切割点不固定，所以在基因工程中很少应用。　　第Ⅱ类酶（）：　如EcoR I(大肠杆菌)、Hind Ⅲ(嗜血杆菌)，分子量较小(约 20，000-100，000)， 这类酶的切割部位有特异性，可准确切割DNA双链的特异序列，因此在基因工程中广泛应用。 ;这类酶的切割点是对称序列。如回文对称序列（又称反向重复序列，即从两个方向阅读，其序列相同的序列）。识别特定的碱基序列，交错切割产生二个粘性末端。 二个平齐末端。 ;三、载体 载体是将“目的”基因即重组DNA分子导入受体细胞的运载工具。DNA载体：质粒、噬菌体、病毒、细菌或酵母菌人工染色体等，现在使用的载体都是采用基因工程的方法构建的。 载体的条件：　①.具有复制原点，能自我复制，并能带动携带的外源DNA一起复制。　②.具多克隆位点，即有多种限制酶的切点；且切点不存在于复制原点或抗性选择标记内，即切点不影响复制和标记性状的表现。　③.至少有一个选择标记基因，便于鉴定进入宿主细胞与否，如抗生素基因或某种酶的基因，而宿主细胞没有这些基因。　④.易从宿主细胞中回收克隆。;一些常用的载体： 　㈠、细菌质粒 ：　　 质粒是细菌细胞内独立于细菌染色体而自然存在的、能自我复制、易分离和导入的环状双链DNA分子，是质粒具有重组表型检测标记，可检测是否携带外源DNA片段。 可用于克隆分子量小于10kb(1kb=1000bp)的外源DNA片段。 ;经典的大肠杆菌质粒载体;6个克隆位点： EcoR I、Xho I、Pvu I、Hind III、BamH I、Sal I 主要使用EcoR I。;③ lacZ的?肽互补;2）受体菌lacZ突变（lacZ?M15）;pUC质粒载体上的lacZ’ 编码?肽与这个缺失突变的?-半乳糖苷酶“互补”，使它能形成4聚体，从而能分解X-gal，产生蓝色物质。;4）?互补的插入失活;④ IPTG的诱导作用;通过看培养皿上的菌斑的颜色就能直接知道是否有DNA插入。;; ㈤、细菌人工染色体(bacterial artificial chromosome，BAC)：　　 BAC载体一般可携带大于50kb的外源DNA片段。F因子改造成BAC载体，甚至可用于克隆100kb以上的DNA片段。 ㈥、酵母人工染色体(yeast artificial chromosome，YAC)：　　YAC具有自主复制序列、克隆位点和可在细菌和酵母菌中选择的标记基因；还具有酵母菌染色体一些特点；　　;四、基因的分离与鉴定 一般而言，一个基因是编码一条多肽链的一个DNA片段包括启动子、终止子及内含子等。 在DNA重组技术出现之前，由于DNA分子量大而结构单一，DNA是细胞中最难分析的大分子。DNA重组技术发展成功之后，DNA已成为细胞中最易操作分析的大分子。 DNA的体外重组： 1. 体外通过限制性内切酶的修剪和DNA连接酶的连接； 2. 目标DNA分子+载体DNA，共价连接； 3. 获得重组DNA分子。;㈠、从基因库中分离基因：　1. 基因库（gene library）：　　是一组DNA和cDNA序列克隆的集合体。从基因库中分离基因，首先要构建基因库