口蹄疫液相阻断ELISAPPT.ppt

A型口蹄疫液相阻断ELISA 2015年12月 一、液相阻断ELISA基础知识 液相阻断ELISA（LB-ELISA）通途： 1、检测口蹄疫感染，广泛用于国际贸易中，是OIE指定方法之一； 2、监测牛、羊和猪等偶蹄动物血清中口蹄疫免疫效价，评价口蹄疫疫苗免疫效果。 BL-ELISA原理图 待检血清与病毒抗原混合液 捕获抗体 检测抗体 病毒酶结合物 显色液 阳性不显色 阴性显黄色 BL-ELISA反应原理： 将预先滴定好的病毒抗原与被检血清首先在液相中反应，然后将抗原抗体复合物转移到包被了口蹄疫特异性抗体的ELISA板中，没有完全被血清抗体阻断的病毒抗原被ELISA板中的抗体捕获，再通过酶结合物与底物显色。按照实验孔呈现颜色与抗原对照（未加血清）孔呈现颜色相比较判定结果。 抗体滴度以阻断50%病毒抗原的血清稀释度表示。 二、实验前准备 1、使用前，试剂盒所有组份应回复到18-26℃，试剂要混合均匀，每个样品使用一个吸头。 2、浓缩洗涤液用蒸馏水或去离子水25倍稀释。 三、实验操作步骤 1、抗原抗体反应布板 1.1稀释病毒抗原：用配制好的洗涤液在孔外6倍稀释病毒抗原。 1.2待检血清稀释：在血清稀释板上，使用洗涤液连续2倍稀释每份被检血清，每份血清稀释2-8孔，根据检测用途而定。使每孔最终量都为50vl。 1.3稀释阳性对照，参照步骤1.2，连续2倍稀释，从1：16-1：1024。 1.4稀释阴性对照，参照步骤1.2，连续2倍稀释，从1：2-1：4。 1.5血清稀释板加样：使用稀释好的病毒抗原加样，其中预设的4孔病毒抗原对照孔按100vl/孔加入，其余待检血清、阴阳性对照按50vl/孔加入。加样完毕，所有样品孔和因阳性对照孔稀释度翻倍，变为图1图、2所示。 1.6将加好样的血清稀释板封板，置于37℃反应2h。 2、样抗原抗体混合液及病毒抗原对照从血清稀释板上按次序转移到包被板上50vl/孔，封板， 37℃反应30Min。 3、洗涤液洗版5次，拍干。加抗体溶液 50vl/孔，封板， 37℃反应35Min。 4、同上洗板5次，拍干。加酶结合物50vl/孔，封板， 37℃反应35Min。 5、同上洗板5次，拍干， 50vl/孔加入底物溶液（显色液A和B按1：1混合），37 ℃避光温育15min。 6每孔再加50vl终止液终止反应，立即在450nm波长下读取OD值。 四、结果分析 1、实验成立条件 病毒抗原对照OD值应在2.0±1范围内。 阳性对照抗体效价应在1：1024±1滴度范围内。 阴性对照抗体效价应＜1：8. 如果实验无效，实验中的操作值得怀疑，最好重新作一遍。 2、结果判定 抗原对照4孔，弃去1个最高和最低值，计算剩余2孔的平均OD值，再除以2，即50%对照值，该值即为临界值，表示阻断50%反应的对照OD450值。 备检血清OD450值＞临界值，判为阴性； 备检血清OD450值≤临界值，判为阳性；