基因扩增检验标本的处理保存及核酸提取方法PPT.ppt

基因扩增检验标本的处理保存及核酸提取方法; 应用聚合酶链反应（PCR）技术测定临床标本中的病原体核酸成分，是一种高度敏感，且最为直接的检测手段。由于临床标本中含有蛋白质、脂类等物质，可干扰PCR反应，故在做PCR反应前必须进行核酸提取。;经典的核酸提取方法通常是加去污剂（SDS等）裂解细胞，经蛋白酶处理、有机溶剂提取及乙醇沉淀等步骤。 ;由于样本的处理及保存对DNA和RNA（尤其是RNA）的影响较大，因此在核酸测定时标本的处理及适当保存对测定结果的准确有效非常重要。;临床常见的标本有血清（浆）、全血、分泌物、棉拭子、脓液、体液、新鲜组织、石蜡切片等，这些临床标本的处理和保存方法各有不同。 ;临床标本的处理;HBV：标本通常由医护人员采集，应注意避免溶血，如为血浆标本注意抗凝剂的选 择，一般用EDTA-Na2或枸橼酸纳，不可使用肝素。标本为全血时，及时分离出血浆，提取病毒DNA进行检测。 ;HCV：检测RNA病毒。由于RNA极易降解，标本的制备和保存方式往往可以影响测定结果。若用血浆标本，应使用EDTA抗凝。严禁使用肝素，因其对PCR扩增有抑制作用, 且无法在核酸提取过程中去除。抗凝后6小时内分离血浆。如用血清标本，则应尽快（2小时内）分离血清 进行检测，或-20oC保存。;全血标本 通常用来提取外周血单个核细胞核酸：如基因组DNA、线粒体DNA、总RNA等。 抗凝剂：一般使用EDTA-Na2、枸橼酸纳，不使用肝素。 ;前处理： 1）加适量的红细胞裂解液（破膜液），裂解全血中的红细胞。 2）再加适量的细胞核裂液（破核液），裂解白细胞中的细胞核，使核内DNA 释放出来。 3）然后再加SDS（十二烷基硫酸钠）等去污剂，溶解脂蛋白，解聚核蛋白。 ;SDS可与蛋白 质结成复合物，使蛋白质变性沉淀，但SDS在以后的核酸提取过 程中必须除去。 ;痰标本 痰属于分泌物，临床上常用作结核杆菌DNA测定样本，由于痰标本中含大量粘蛋白和杂质，故在核酸提取时，一定要对标本进行前处理，即用4%NaOH液化，去除粘蛋白，然后用煮沸或蛋白酶、酚/氯仿等经典法提取DNA。;具体方法：;12000 rpm，离心15分钟 弃上清，加无菌生理盐水1 ml ，混匀，12000rpm离心5分钟 弃上清，沉淀物用于 DNA提取 ;棉拭子 用PCR方法检测性病病原体时（衣原体、支原体、淋球菌、梅毒螺旋体、人乳头状瘤病毒等），临床标本一般为棉拭子。标本取材是关键，衣原体等病原体感染上皮细胞，因此取材一定要取到细胞。;具体方法：; 同上，重复洗涤一次 弃上清，沉淀即可用于DNA提取 ;5．体液 体液标本，包括胸水、腹水、脑脊液、尿液等，可直接离心，取沉淀物提取核酸。 血性胸腹水，可使用红细胞裂解液处理：;加等体积红细胞裂解液，震荡混匀，置5-10分钟 10000rpm，离心5分钟，弃上清 可根据情况重复2-3次，沉淀物用于DNA提取 ;6．脓液 粘稠脓液：同痰标本处理，先用4%NaOH液化，再离心取沉淀提取DNA。 水样脓液：直接离心，沉淀用生理盐水洗2-3次后用于DNA提取。;7．组织 组织有新鲜组织和石蜡切片。 新鲜组织的处理步骤： 先用生理盐水洗二次，然后将其捣碎或剪碎（用眼科剪），加蛋白酶K消化后提取核酸;石蜡切片用于核酸提取，需先用二甲苯脱蜡，再用蛋白酶K消化后进行DNA提取。 ;标本的保存;血清（浆） HBV：分离出的血清（浆）如不立即提取核酸，保存于-20oC待检。 HCV：尽快分离血清(浆), 如不立即提取RNA， 保存于-20oC待检。;长期保存：吸取200μl血清，加20u RNasin（RNA酶抑制剂），保存于-70C。 已发出结果报告的标本应及时转移至冰箱保存，并由专人负责管理，保存1-2周（时间长短根据报告单上的承诺而定）。 ;全血标本 全血标本如用于DNA提取，可4oC下短期保存（数天），时间长易降解，如用于RNA检测，应在取血后尽快提取RNA。 最好将DNA或RNA提取后，置-70oC保存。;痰 液化的痰标本如不立即用于核酸提取，可保存于-20oC。 处理后的棉拭子、体液、脓液如不立即用于核酸提取，可保存于-20oC。;组织 新鲜组织最好保存于50%乙醇中，具体方法：先用生理盐水将组织洗一次，切成小块，加入适量生理盐水，然后边摇边加入无水乙醇至终浓度为50%，这样固定的组织标本室温下可保存数日，4oC可保存6年。; 总而言之，标本的保存及适当的预处理对核酸模板的成功提取具有决定性作用。要强调的是，所有用于上述处理的容器如试管或离心管，均应在使用前压灭菌。;核酸的提取;核酸包括DNA、RNA两种分子，在细胞中都是以与蛋白质结合的状态存在，核酸提取的主要步骤为： 裂解细胞 去除与核酸结合的蛋白质以及多糖、脂类等