基因表达的检测PPT.ppt

胶浓度的选择： 丙烯酰氨浓度 蛋白线性分离范围/KDa 15 12 10 7.5 5 10－43 12－60 20－80 36－94 57－212 加样与电泳： 加适量的样品（200－1000ug总蛋白量）、对照及蛋白分子量marker 180－200volts电泳直到溴酚蓝跑出凝胶（Bio-Rad电泳装置） 凝胶染色： 考马斯亮蓝（R－250）染色 银染 印迹转移： 原理：带正电荷的蛋白质在电场作用下从负极（凝胶）向正极（尼龙膜或硝纤膜）迁移，蛋白质通过疏水作用结合到膜上 4℃条件下，300mA电泳1－3小时（Bio-Rad电泳装置） 封闭： 5%脱脂牛奶或5%BSA，室温下1小时（或4℃过夜） 一抗反应： 选择合适的第一抗体 适量抗体以5%脱脂牛奶或5%BSA稀释 室温下1小时（或4℃过夜）反应 二抗反应： 选择合适的酶标第二抗（第一抗体）体 适量抗体以5%脱脂牛奶或5%BSA稀释 室温下1小时（或4℃过夜）反应 加生色底物显色 HRP的底物： 生色：4－氯－1－萘酚/H2O2 发光：ECL溶液（鲁米诺/4－碘代酚/ H2O2 ） AP的底物： 生色：氮蓝四唑/5－溴－4氯吲哚磷酸 发光：AMPPD 拍片或曝光、洗片 0 hr 2 hr 4 hr 6 hr 8 hr 10 hr 12 hr 14 hr p53 p21 ?-Tubulin Time after irradiation DNA damage induces down-regulation of histone gene transcription which parallels cell cycle arrest 优缺点： 优点： 不须纯化而直接反映其中单个蛋白表达水平的变化 用于观察细胞处理后最后一步变化，结果最可靠、真实 实验简单可靠、重复性好 缺点： 不能反映蛋白质变化的中间过程 灵敏度相对较低，多用于检测细胞表达量较大的蛋白质的变化 对抗体的依赖度高 应用： 直接检测蛋白质的有无、变化 可直接检测部分蛋白的功能 与其它方法结合后，可检测蛋白－蛋白相互作用 酶联免疫吸附试验（ELISA） 原理： 将可溶性蛋白质（单一组分或混合组分）固定于酶标板壁上－－抗原或抗体 检测待检蛋白－－抗体或抗原 固 定 物 1Ab 2Ab E 蛋白质 （抗原） 2. 操作过程（间接法、双抗体夹心法） 样品处理： 已知样品必须是可溶性蛋白－－溶于PBS、水等 样品可以是单一组分或混合组分 包板： 适量的抗原以高PH溶液（PH7.6－7.8的碳酸盐缓冲液）或低PH溶液（PH4.8枸椽酸盐缓冲液）稀释后包被酶标板 4℃反应1－2天 PBS洗涤后，即可使用该板或可较长期保存 封闭： 4%脱脂牛奶或4%BSA，室温下1小时（或4℃过夜） 一抗反应： 选择合适的第一抗体 适量抗体以4%脱脂牛奶或4%BSA稀释 室温下1小时（或4℃过夜）反应 二抗反应： 选择合适的酶标第二抗（第一抗体）体 适量抗体以4%脱脂牛奶或4%BSA稀释 室温下1小时（或4℃过夜）反应 加生色底物显色： HRP的底物： H2O2/TMB 终止：2M H2SO4 结果判断： 目测法 仪器法 优缺点： 优点： 用于观察细胞处理后最后一步变化，结果可靠、真实 方法简单（多样）、快速 可大批量检测标本 敏感性较高 缺点： 不能反映蛋白质变化的中间过程 多用于检测细胞表达量较大的可溶性蛋白质的变化 特异性相对较低，重复性相对较差 对所用抗体的依赖度高 应用： 大批量、直接检测可溶性蛋白质的有无、变化 What is Flow Cytometry? Flow Cytometry is a powerful technique for cell counting, sorting and surface marker analyzing Flow Cytometry can provide quantitative information about cell surface markers Based on immunofluorescence technique and computer-aided analysis 流式细胞仪（FACS）检测 原理：基于单个细胞水平的检测 Fluorescence-activated cell sorter (FACS) FACS is one version of Flow Cytometry, which can sort cells by their surface markers Individual cell is positively or negatively charged based on their fluorescence color When ch