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专硕1班：邓剑平 学号：2111740137;目录;;国内外研究现状： 目前普遍推行的乙肝疫苗主要是由重组的酿酒酵母、汉逊酵母或中国仓鼠卵巢细胞表达的乙型肝炎病毒表面抗原添加到氢氧化铝或磷酸铝佐剂中制备而成。全程免疫后，９５％的免疫人群均可产生ＴＨ２型体液免疫应答，从而起到抗感染的保护作用。然而，它对于早期细胞免疫，阻断病毒母婴传播并不能发挥有效作用，对于肝细胞内寄生的ＨＢＶ，亦不能发挥细胞免疫作用，也不能有效清除病毒。现行乙肝疫苗全程免疫一般需要多次注射， 不断加强免疫效果， 才能诱发机体产生长效的免疫应答。 近年来，接种乙肝疫苗的不良反应在国内外已经引起广泛关注，且不良反应范围甚广，如可以引起过敏性休克，一旦发生后果很严重。影响疫苗免疫效果的因素主要抗原纯度、使用的佐剂、灭活方法和贮存条件等。提高乙肝疫苗的免疫原性，增强各人群对疫苗的应答水平，简化免疫程序，改变给药方式，既能发挥免疫预防作用，又可以有效清除病毒并达到治疗效果，是有效遏制乙型肝炎的发展趋势;乙肝疫苗的结构特点： HBV DNA的两链长短不一，长链（L）完整，为负链，长度恒定，约3200个核苷酸。短链（S）为正链，长度可变，约为长链长度的50～100%，链的增生按5′-3′顺序进行。在不同分子中短链3′端的位置是可变的，而短链和长链的5′端位置固定点为粘性末端，通过250～300个核苷酸碱基配对，以维持DNA分子的环状结构。在粘性末端两侧，两链5′端各有一个由11个bp组成的直接重复序列 (Direct repeat DR)-5′TTCACCTCTCC，该DR位于第1824个核苷酸者称DR1，位于第1590个核苷酸者称DR2，在病毒复制中起作用。 ;常见的HBV病毒基因变异;目前专利情况（来源于药渡网） 目前国内外对乙肝疫苗的开发比较成熟，全球有31个已经批准上市，有14个处于临床试验，专利申请数量有22个，中国CED注册与受理的有133个公司机构，以国内本土企业居多。 ;乙肝疫苗的生产过程;Step 2 . HBsAg重组子的构建及筛选 用EcoRI 和 Nhe I双酶切扩增出来的DNA片段及p CIneo质粒，用DNA连接酶连接切割产物，将连接产物转入大肠杆菌（DH5α）感受态细胞。在涂布有氨苄青霉素的平板上进行阳性筛选。;生产工艺与质量控制体系的建立 1、细胞库（菌种）：（大肠杆菌、目的基因（HBsAg）、载体（p CIneo质粒）、杂菌、病毒、致病基因的质量控制）在同一实验工作区不得同时操作两种不同菌种， 同一工作人员不得同时操作两种不同细胞。 细胞染色标记方法测细胞活性，这才能真实反映生产的药物效价 MTT ＞3H-Thymidine ＞流式细胞仪 （测细胞周期、凋亡） 2、发酵工艺及分离纯化工艺（中间体）：表达水平、 总产量的测定 （1）有限代次生产控制：对培养和诱导基因产物的材料有详尽的资料，培养过程及收获时，有灵敏的检测措施。在生产周期结束时，做质粒拷贝数、大肠杆菌表达载体存留的程度、含插入基因的载体的酶切图谱。 （2）纯化工艺过程的控制：尽量除去污染病毒、核酸、宿主细胞、杂蛋白等及纯化过程带来的有害物质。这些可以利用凝胶、离子交换等层析方法来进行除杂。 3、最终产品的控制 对产品的鉴别、纯度、稳定性和活性等的试验方法，检测项目与纯度要求要根据纯化工艺过程、产品理化性质和用途等来确定。 （1）物理化学鉴定：包括氨基酸成分分析、部分氨基酸序列分析、肽图分析、聚丙烯酰胺凝胶电泳及等电聚焦、高效液相色谱、残余细胞DNA测定、其他外源性物质测定 （2）生物学测定：包括鉴别试验、效价测定、热原质试验、病毒污染检查、无菌试验、抗原物质检查、毒性试验 ;临床前药理学研究和安全性评价 1、建立HBV实验模型 可利用小鼠来制造病理模型 2、药理研究： （1）主要药效学研究：将实验小鼠分成两组：空白对照组（不注射乙肝疫苗）和实验组（注射乙肝疫苗），分布不同给药剂量，通过观察治疗效果。 （2）一般药理学研究 对神经系统影响：观察受试小鼠的行为变化，检测其神经中枢兴奋或抑制状态； 对心血管系统影响：测定受试小鼠血压、心电图、心率和心律变化 对呼吸系统影响：测定受试小鼠呼吸频率和深度 3、毒理研究包括： 3.1单次给药毒性试验： 试验时间一般1～2周，检测指标包括体重、笼旁观察、大体解剖检查等。可以得到关于全身和/或局部毒性的剂量-效应关系数据，这些数据可用于选择重复给药毒性试验的剂量。 ;3.2重复给药毒性试验: 试验的持续时间应基于临床的接受剂量和适应症，乙肝疫苗注射时间为1-3个月。检测指标包括急毒试验中常规的项目, 还有特殊检测项目的如眼底镜检查、心电图描记、体温、血压等。 3.3安全