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免疫组织化学的操作和抗原修复 四川大学华西医学院病理学教研室张文燕 2004.03 内容 标本的准备和处理 抗原修复 免疫组化染色的基本步骤 标本的准备和处理 取材 贮存 固定 切片 标本的种类 人体标本：活检、手术、尸解、细胞 实验动物标本 新鲜标本 已固定标本 细胞标本 组织标本 取材（tissue cutting） 迅速、准确、完整、具有代表性 组织块的大小 1.0 cm× 1.0cm× 0.2cm 实验动物标本 灌注固定：生理盐水 4%多聚甲醛 （10%福尔马林） 人体标本 活检标本 避免挤压 取材准确 手术标本 病变 病变与正常交界处 病变周围正常组织 细胞标本 印片 穿刺涂片 体液细胞 体外培养细胞标本 贴壁生长的细胞 悬浮生长的细胞 勿忘标记！ 标本的冻存 -4℃：1周 -20℃：1~3月 -70℃：6~12月 固定（fixation） 目的 保持组织形态结构完整 保存组织抗原 注意事项 根据研究目的不同选择合适的固定剂 Masson染色：甲醛升汞、Zenker液、 Bouin液 保存细胞内糖原：Carnoy液 显示尿酸盐结晶：100%酒精 注意事项 固定剂要足够量 组织块不能过厚固定时间不要过长 缓冲福尔马林：6~12h,RT Bouin液：2~4h,RT 固定后充分水洗 抗原修复的方法 加热抗原修复 酶消化处理 混合 加热抗原修复的操作要点 防脱片处理 保持切片完全浸泡 容器保持干净 自然室温冷却 免疫组化操作步骤（石蜡切片，LsAB法） 1．二甲苯脱蜡至水二甲苯 15分钟，1次二甲苯 15分钟，1次100%酒精 2分钟，1次95%酒精 2分钟，1次80%酒精 2分钟，1次70%酒精 2分钟，1次蒸馏水洗 5分钟，2次 ?2．阻断内源性过氧化物酶3%过氧化氢(3％过氧化氢甲醇溶液)处理，室温， 20分钟蒸馏水洗，5分钟，2次 3．抗原修复将切片置于1mM柠檬酸钠缓冲液（PH6.0）中，待煮沸后高压加热3分钟自然冷却至室温?4．PBS洗，5分钟，2次 5．正常血清封闭（1∶20），37℃，20分钟?6．滴加一抗，37℃孵育，30分钟。4℃，过夜?7．PBS洗，5分钟，2次 8．滴加二抗，37℃孵育，30分钟?9．PBS洗，5分钟，2次?10．滴加三抗（SP复合物），37℃孵育，30分钟?11．PBS洗，5分钟，2次 12．DAB显色，适时镜下终止，自来水冲洗按下述比例配制DAB显色液DAB贮存液（25mg/ml） 20μl0.01M PBS 1ml3%过氧化氢 3μl 13．苏木素复染3分钟，1%盐酸酒精分色数十秒，自来水返蓝15分钟。梯度酒精脱水，二甲苯透明。中性树胶封片 切片准备 5m厚的冷冻切片裱于普通的清洁载玻片上 空气干燥30秒 丙酮固定1分钟 空气干燥30秒，室温 无需进行内源性过氧化物酶阻断处理 免疫组化染色步骤1．PBS（0.01M，Ph7.4）洗，3分钟。2．滴加一抗，37℃孵育，30分钟。3．PBS洗，10秒。4．滴加EnVision复合物，37℃孵育，3分钟。5．PBS洗，10秒。6．显色：高敏DAB，37℃，3分钟7．流水冲洗10秒。双蒸水洗，5秒。8．苏木素复染，15秒。42℃水洗30秒，封片。 操作要点 确保抗体的孵育和显色过程在37℃条件下进行 推荐使用相对高浓度的第一抗体。 手术中冷冻切片的快速免疫组化染色 上皮源性肿瘤较好地表达CK、EMA；肺和胃肠腺癌表达CEA 1例平滑肌肉瘤表达Vimentin 1例乳腺血管肉瘤表达CD34、CD31 1例恶性胃肠间质肿瘤瘤细胞呈CD34和CD117阳性反应 数例不同组织的炎性病变中的淋巴细胞表达CD45、CD20、CD45RO标记 乳腺纤维腺瘤之腺管的基底膜表达IV型胶原，而浸润性导管癌之癌巢周围IV型胶原呈断续表达，同时表达MMP-2。 判断免疫组织化学染色阳性反应?（以DAB显色、苏木素复染者为例） 若细胞核呈现棕黄色细颗粒状物质沉积， 则为细胞核阳性反应 细胞核呈兰色者则为阴性反应 若在细胞核经苏木素复染呈兰色背景上， 细胞核周围见膜状或线状棕黄色