有机酸的测定－－高效液相色谱法 - PowerPoint Presentation.ppt

一、实验目的 学习和掌握有机酸样品的处理和HPLC检测方法。 进一步了解高效液相色谱仪的使用操作性能。 掌握标准工作曲线的建立、数据的处理及定量分析。 二、原理 果蔬及其制品、各种酒类、乳及乳制品中的主要有机酸可用高效液相色谱进行测定。样品经过处理、离心及超滤，用C-18反相柱和pH2.65的纯蒸馏水作流动相，在紫外214nm处定量测定。 三、材料与仪器 材料：果蔬、橘汁、酒等。 仪器：高效液相色谱仪（Agilent 1100)、 分析天平、组织捣碎机、研钵、三角瓶、 水浴、离心机、0.45um滤膜、溶剂过滤 器、 样品过滤器等。 四、试剂 磷酸（AR） 流动相的制备：用磷酸调节新配制的重蒸水pH至2.65,置超声波振荡仪上排气后用0.45um膜过滤，待用。 有机酸标准母液配制：分别称取苹果酸10mg，柠檬酸10mg、酒石酸5mg，琥珀酸20mg，延胡索酸10mg，吸取乳酸10ul，冰乙酸10ul，置100ml棕色容量瓶中，以 pH2.65重蒸水溶解并定容，使有机酸的浓度分别为100,100,50,200,100,100和100mg/kg. （本实验只配苹果酸10mg，柠檬酸10mg、酒石酸5mg定容到100ml为母液） 7种有机酸标准混合液，吸取各有机酸10 ml定容到100ml，即可作工作液。 （本实验只配MA、CA、TA三种标准混合液） 五、操作步骤 （一）样品制备 称取水果(苹果）200g左右，洗净、切碎，用组织捣碎机匀浆，称样品10g，置三角瓶中，加入pH2.65 重蒸水60－70ml，沸水浴中加热60min以浸提有机酸，冷却，用pH2.65重蒸水移入100ml容量瓶中，定容，过滤，再用 0.45um微孔滤膜过滤，待上机测定。 （二）色谱条件 色谱柱:十八烷基硅烷键合硅胶填料Octadecylsilyl，简称ODS）C-18(150*3.9mm,walers) 流动相：pH2.65重蒸水（用磷酸调制） 流速：0.4ml/min 检测器：UV214nm 柱温：18~20度 进样量：20ul （三）标准曲线的制作 取有机酸标准母液(苹果酸）用倍比稀释法稀释成100ug/ml,50ug/ml,25ug/ml,12.5ug/ml, 6.25ug/ml,3.125ug/ml浓度，进样量为20ul,进行分离，并以各种有机酸的浓度对峰高（或峰面积）分别制成标准曲线。在标准曲线的线性范围内进行样品中各种有机酸含量的测定。 （四）样品测定： 取样品处理液20ul 进行色谱分析，以标准色谱图进行对照，根据保留时间确定样品中的各种有机酸。 六、计算 按下列公式计算样品中各种有机酸的含量（C） C=N*(H/Hm)*F.50.(V/W).(1000/1000) 式中：C—各种有机酸的含量，以mg/kg(L)表示 N—20ul有机酸含量ug/20ul H—样品中某种有机酸的峰高(mm) Hm—标准溶液中某种有机酸的峰高（mm) F—稀释倍数 V—样品的定容体积（100ml) W—样品的称取量（g或ml) 本实验用样品洗脱曲线的峰面积查标准曲线计算结果。注意单位换算。 七、注意事项 本方法的回收率试验表明，除易挥发的乙酸外，其它有机酸的回收率都较理想。 实验中可用已知浓度的苹果酸25ug/ml,进样20ul计算样品回收率。 上机之前对各样品及标样用0.45um膜过滤2ml左右，并用剩余的样品测 pH值, pH小于2.5不能上机。 手动进样时必需用力均匀，水平注入，避免进样引起误差。 八、实验报告要求 预习报告：根据查阅有机酸测定文献资料及教材写出预习报告。 实验报告： 1、各浓度标准苹果酸洗脱图 2、样品洗脱图。（要求编辑成WORD文档打印） 3、绘制标准工作曲线（在EXCEL中进行打印）。 4、结果计算报告 实验分组安排 全班以2人/组为单位，进行提取样品一份供检测，约1小时左右。 液相系统条件设定平衡1小时左右 100ug/ml,50ug/ml,25ug/ml,12.5ug/ml,6.25ug/ml,3.125ug/ml浓度苹果酸进样，绘制工作曲线，约1小时左右。 样品进样分析测定：1-15组轮流进样（约20分钟/组） 系统冲洗维护。 思考题 1、有机酸的测定—HPLC法中样品峰的定性依据是什么？ 2、通过本次实验要想得到分离效果较好的样 品洗脱图谱的工作条件主要取决于哪些？ 3、HPLC法测定有机