[农学]《现代分子生物学》第七讲 分子.ppt

第七讲 分子生物学研究方法 （一）DNA分析技术（续） 本章主要内容： 1、DNA测序技术； 2、重组DNA技术发展史； 3、基因克隆技术； 4、DNA分析技术：SNP的理论与应用。 二、DNA重组技术 基因扩增（聚合酶链反应PCR技术） 　首先将双链DNA分子加热分离成两条单链，DNA聚合酶以单链DNA为模板并利用反应混合物中的四种dNTP合成新生的DNA互补链。 　因为DNA聚合酶需要有一小段双链DNA来启动（“引导”）新链的合成，所以，新生DNA链的起点由寡核苷酸引物在模板DNA链两端的退火位点所决定。 　　　整个PCR反应的全过程，即DNA解链（变性）、引物与模板DNA相结合（退火）、DNA合成（链的延伸）三步，可以被不断重复。经多次循环之后，反应混合物中所含有的双链DNA分子数，即两条引物结合位点之间的DNA区段的拷贝数，理论上的最高值应是2n。 主要步骤： 将含有待扩增DNA样品的反应混合物放置在高温（94℃）环境下加热1分钟，使双链DNA变性，形成单链模板DNA。 然后降低反应温度（约50℃），致冷1分钟，使寡核苷酸引物与两条单链模板DNA发生退火作用并结合在靶DNA区段两端的互补序列位置上。 最后，将反应混合物的温度上升到72 ℃保温1-数分钟，在DNA聚合酶的作用下，从引物的3-端加入脱氧核苷三磷酸，并沿着模板分子按5→3方向延伸，合成新生DNA互补链。 PCR实验注意事项 实时定量PCR（Real Time quantitative PCR) 相同模板在同一台PCR仪上进行96次扩增的扩增曲线图 获得了用外源DNA片段和载体分子重组而成的重组DNA分子后，还必须通过一个被称为细菌转化的过程将其重新导入到寄主细胞中，才能保证重组DNA分子的增殖。 重组子导入受体细胞的途径 将外源重组体分子导入受体细胞的主要途径包括转化（或转染）、转导、显微注射和电穿孔等。转化和转导主要适用于细菌一类原核细胞和酵母等低等真核细胞，而显微注射和电穿孔则主要应用于高等动物的真核细胞。 细菌转化 所谓细菌转化，是指一种细菌菌株由于捕获了来自另一种细菌菌株的DNA而导致性状特征发生遗传改变的生命过程。提供转化DNA的菌株叫作供体菌株，接受转化DNA的细菌菌株则被称为受体菌株。 感受态细胞（Competent Cell) 绝大多数细菌，包括大肠杆菌，正常情况下仅能获取极少量的DNA。为了高效转化这些细菌，必须对受体细菌进行一些物理或化学处理，以增加它们获取DNA的能力。 将快速生长中的大肠杆菌置于经0℃预处理的低渗氯化钙溶液中，使细胞膨胀形成原生质球，与外源DNA形成粘附在细胞表面的复合物。 42℃下做短暂热刺激，复合物便会被细胞所吸收。在全培养基中生长一段时间使转化基因实现表达，就可涂布于选择性培养基中分离转化子。 重组基因的筛选 1、耐药性基因 抗药性基因（四环素和氨苄青霉素），当缺失抗 药性基因的大肠杆菌被成功转化时，它便从该质粒获得了抗生素抗性。 2、蓝白斑筛选 检测是否有外源DNA插入的标记基因LacZα，可利用?-互补原理进行蓝白筛选。 质粒DNA的分离纯化 （一）、细菌培养物的生长和收获 （二）、质粒DNA的提取 在pH值介于12.0～12.5的条件下加热DNA溶液，线性DNA会被变性，而闭合环状质粒DNA则不会被变性，互补的两条链仍然会紧密地结合在一起。染色体DNA的两条链则会完全分开。若用制冷或恢复中性的方法处理DNA混合物，质粒DNA能迅速而准确地复性，但随机断裂产生的线性染色体DNA分子，彼此已经分离的互补链之间的复性作用就不会那么迅速而准确，往往聚集形成网状结构，与变性的蛋白质及RNA一道被离心沉淀下来。可以用酒精沉淀法收集仍然滞留在上清液中的质粒DNA。 质粒DNA的鉴定 （一）、紫外光谱分析 通常使用样品的吸光度鉴定其浓度和纯度。 （二）、EB荧光分析 （三）、电泳鉴定 在凝胶电泳中，DNA分子的迁移速度与分子量的对数值成反比关系。质粒DNA经单一酶切后与DNA Marker进行电泳对照，即可知该质粒的分子量大小。 5、DNA操作技术 1、核酸的凝胶电泳 自从琼脂糖（agarose）和聚丙烯酰胺（polyacrylamide）凝胶被引入核酸研究以来，按分子量大小分离DNA的凝胶电泳技术，已经发展成为一种分析鉴定重组DNA分子及蛋白质与核酸相互作用的重要实验手段。 基本原理 一种分子被放置到电场中，它就会以一定的速度移向适当的电极。我们把这种电泳分子在电场作用下的迁移速度，叫做电泳的迁移率，它与电场强度和电泳分子本身所携带的净