[医学]原位杂交.ppt

实验二 原位杂交 原位杂交即用已知核酸序列作为探针，并标记上示踪物，按碱基配对原则与组织中特定序列的核酸片段结合，以检测组织中是否存在某种特定基因序列，及其在生物体内分布的部位、含量等。 　该检测方法，可以测定DNA，也可以检测mRNA。本实验用地高辛标记的大鼠ecNOS和iNOS寡核苷酸三相探针，检测组织中ecNOS-mRNA和iNOS-mRNA的表达。 一、常规原位杂交流程 (一) 常规原位杂交流程Ⅰ 1. 0.1mol/L PBS(pH7.2)冲洗,5 min ×3 2. 含0.1mol/L甘氨酸的0.1mol/L PBS(pH7.2) 5 min 3. 含0.4%TritonX-100的0.1mol/L PBS(pH7.2) 15 min 4. 1ug/ml蛋白酶K 37℃ 30min。 5. 4%多聚甲醛PBS(pH7.2) 5min 6. 0.1mol/L PBS(pH7.2) 3 min×2 7. 0.25%乙酸酐(0.1mol/L三乙醇胺配制)10min 8. 2×SSC 5 min×2 9. 30%、60%、80%、95%、100%乙醇各2 min 10. 含探针杂交液10ul(2ng/ul),加盖片, 37℃过夜 11. 去盖片,50%甲酰胺/2×SSC 37℃ 15 min, 2×SSC 37℃ 15 min, 12. 1×SSC 室温 15 min 13. 4×SSC 室温平衡5 min, 吸去残余缓冲液(勿 干涸) 14. 封闭液(200ul),加盖片,湿盒, 37℃ 30 min 15. Anti-DIG-AP(40ul),加盖片,湿盒37℃ 30 min 16. PBS×2 17. Buffer3 (pH9.5) 5 min×2 18. NBT/BCIP(暗处15-60 min) 19. PBS 5min终止反应 20. 复染, 封片。 (二) 常规原位杂交流程Ⅱ 1. 0.1mol/L PBS(pH7.2)冲洗,5 min ×3 2. 含0.1mol/L甘氨酸的0.1mol/L PBS(pH7.2) 5 min 3. 含0.4%TritonX-100的0.1mol/L PBS(pH7.2) 15 min 4. 1ug/ml蛋白酶K 37℃ 30min。 5. 4%多聚甲醛PBS(pH7.2) 5min 6. 0.1mol/L PBS(pH7.2) 3 min×2 7. 0.25%乙酸酐(0.1mol/L三乙醇胺配制)10min 8. 2×SSC 5 min×2 9. 30%、60%、80%、95%、100%乙醇各2 min 10. 含探针杂交液10ul(2ng/ul),加盖片, 37℃过夜 去盖片,50%甲酰胺/2×SSC 37℃ 15 min, 2×SSC 37℃ 15 min, 12. 1×SSC 室温 15 min 13. 4×SSC 室温平衡5 min, 吸去残余缓冲液(勿干涸) 14. 封闭液(200ul),加盖片,湿盒, 37℃ 30 min 15. Anti-DIG-Biotin 200ul,盖玻片,湿盒37℃,30min 16. 42℃,0.1%Tween 20 /PBS 摇洗5 min×3 17. SABC-POD 200ul,盖玻片,湿盒37℃,30min 18. 42℃,0.1%Tween 20 /PBS 摇洗5 min×3 19. DAB 200ul,盖玻片,室温,暗处,10-20min 20. PBS 5min(终止反应),复染,90%甘油封片. 二、优化原位杂交操作流程Anti-Digoxin-AP- NBT/BCIP系列 1. 组织固定：4%多聚甲醛/0.1molPBS固定24h。 （组织块0.5×1.0cm3,固定液与组织之比为15:1) 2. 切片:(片厚8-15um)37℃过夜 3. 蒸馏水洗, 3 min×2 4. 0.05mol/L vitamine C 30min 5. 0.1mol/L PBS(pH7.2) 3 min×2， 蒸馏水洗一次 6. 干燥切片(超净工作台内，表面刚干为度)。 7. 杂交液10ul(2ng/ul), 湿盒37℃过夜 8. 2×SSC 30-37℃水浴中冲洗 5 min×3 9. 0.2×SSC 30-37℃水浴中冲洗 10min×1 10. 封闭液室温20min 不洗 11. Anti-DIG-AP(100ul),湿盒37℃ 1h [抗体以封闭液 按 1：50稀释