[医药]xb六、细胞融合与杂交瘤技术.ppt

第六章 细胞融合与杂交瘤技术 2.发生： 自然界存在很多细胞融合现象，如： 受精、成肌细胞融合，但频率低； 细胞内吞与外排也属细胞膜融合现象； 细胞内膜系统物质运输过程等。 4. 细胞融合的分类 ●基因型相同的细胞融合，形成的双核或多核细胞，称同核体（homokaryon）； ●不同基因型的细胞融合形成的双核或多核细胞，称异核体（杂种细胞）。 　　　短期死亡； 　　　有丝分裂→双亲染色体融合→分裂成二→合核体（synkaryon）（也称单核杂种细胞） 细胞融合技术分类： 动物细胞融合 细胞 细胞融合 人为方法 构建 植物细胞 自然融合 技术 原生质体融合 细胞拆合——人为方法，人为组合 原理： Kao等认为，由于PEG分子具有轻微的负极性，故可以与具有正极性基团的水、蛋白质和碳水化合物等形成H键，从而在在质膜之间形成分子桥，其结果是使细胞质膜发生粘连进而促使质膜的融合；另外，PEG能增加类脂膜的流动性，也使细胞的核、细胞器发生融合成为可能。 影响因素： 分子量：400—6000（通常：1000—4000） 浓度： 20—60% （通常：30—50%） 时间： 悬浮法 1—2 min 离心法 5—8 min pH： 偏碱为宜（pH7.4—8.0） 其他： 二甲亚砜、植物血凝素 甜菜原生质体电融合过程 4. 不同细胞融合的条件及其主要应用 原理：两种亲本细胞融合的混合物中可能有多种类型细胞，筛选的目的是获得优良的杂种细胞。 1）亲本 2）同核体 3）异核体 抗药性筛选系统：利用生物细胞对药物敏感性差异筛选杂种细胞。 　如，亲本A：对氨苄青霉素敏感，对卡娜霉素不敏感 　　　亲本B：对卡娜霉素敏感，对氨苄青霉素不敏感 　　　杂种细胞可以在含有两种抗生素的培养基上生长 HAT选择系统 HAT是含一定浓度次黄嘌呤（H）、氨基喋呤（A）及胸腺嘧啶核苷（T）的一种选择性培养基，其中三种成分与细胞DNA合成有关。 DNA合成途径有两种： 营养互补筛选系统：细胞在缺乏一种或几种营养成分时，不能生长繁殖，即营养缺陷型细胞。利用两种亲本细胞营养互补作用原理可以筛选杂种细胞。 　如，亲本A：色氨酸缺陷型 　　　亲本B：苏氨酸缺陷型 　　　杂种细胞可以在不含色氨酸和苏氨酸的培养基上培养，而亲本细胞均会死亡。 温度敏感突变型：一般的培养细胞能在32度到40度的范围内生长，但温度敏感突变型的细胞能在高温或低温下生长。由此筛选杂种细胞。 　如，亲本一：具有卡那霉素抗性但只能在37度左右生长。 　　　亲本二：高温敏感突变型，但不能抗卡娜霉素。 　　　杂种细胞能在高温和含卡娜霉素的培养基上生长。 荧光激活细胞分选仪：用不同荧光素标记的脂质染料分别处理参与融合的亲本细胞，在激光的激发下，融合细胞能发射两种荧光，由此筛选杂种细胞。 　如，亲本一：用RB200标记，发明亮橙色荧光。 　　　亲本二：用FITC标记，发黄绿色荧光。 　　　杂种细胞能发射两种荧光。 2. 杂交细胞表型及其控制 杂交细胞的遗传表型具有多样性（双亲特征都有，且植物细胞能与动物细胞杂交）和不稳定性（染色体排斥、基因丢失，可以用来进行基因定位）； 狭义的杂交细胞遗传表型的控制——是指基于对杂交细胞的基因型和（或）表型动态分析的基础上，使有利用价值或人们关注的表型得到维持的措施。 杂交细胞遗传表型的控制过程： 遗传表型的动态观察和定期分析 （核型与带型）  建立种子细胞库，定期传代分种， 避免细胞过度生长 稳定的染色体数（或倍性、个数变化）与带型，能有稳定的产物 抗体是由B细胞受抗原刺激后所分泌的蛋白质。 抗体分子： 由四条肽链所组成，两条重链（H链）两条轻链（L链）。 结 合 区： 抗体分子上有两个抗原结合区 可变区（V区） 稳定区（C区） ●杂交瘤技术（hydridoma technique，也称MAb制备技术） ——是指建立杂交瘤细胞系的技术；通常指B细胞杂交瘤技术，即将骨髓瘤细胞与B细胞融合，以建立能分泌特定的均质抗体。 ●MAb ——系指由一个B细胞克隆产生的，只识别某一特定抗原决定簇的均质抗体。 ●克隆（cloning） ——指无性繁殖系，也指通过一定方法获得由单个细胞无性繁殖形成的细胞集落。 ① 淋巴细胞产生抗体的克隆选择学说，即一种克隆只产生一种抗体； ② 细胞融合技术产生的杂交瘤细胞可以保持双方亲代细胞的特性； ?③ 利用代谢缺陷补救机理筛