细胞培养技术2013.09.02新版PPT.ppt

细胞培养技术与应用 ;概述;组织培养中感兴趣的研究领域 ;内 容;一、细胞培养的基本理论;（一）细胞培养技术的历史;我国体外培养技术的发展： 20世纪50年代以后，如张钧、鲍鉴清分别在上海、北京开展部分相关工作 1952 鲍鉴清 天津 第一实验室 1955 编写 第一本 《组织培养技术》 1995年 鄂征主编《组织培养和分子细胞学技术》一书 其他还有：郭辉玉、高尚荫、鄂征、陈瑞铭等. ; 由于组织培养在医学研究中的应用，如抗病毒疫苗的生产等，现已经逐渐发展成为一门精细技术。许多细胞株、细胞系的培育成功，尤其是以人的肿瘤组织为材料建立的各种细胞系，如Hela细胞系（Gey，1952），可用来进行一系列研究，更加促进了组织培养技术的发展。 ;;（二）基本概念 ;;;;4、体外培养细胞的生长增殖过程;（1）原代培养（Primary Culture）期：　　即从体内取出组织接种培养到第一次传代阶段，一般持续1一4周。此期细胞呈活跃的移动，可见细胞分裂，但不旺盛。初代培养细胞与体内原组织在形态结构和功能活动上相似性大。细胞群是异质的（Heterogeneous），也即各细胞的遗传性状互不相同，细胞相互依存性强。如把这种细胞群稀释分散成单细胞，在软琼脂培养基中进行培养时，细胞克隆形成率（Cloning Efficiency）很低，即细胞独立生存性差。克隆形成率即细胞群被稀释分散成单个细胞进行培养时，形成细胞小群（克隆）的百分数。初代培养细胞多呈二倍体核型；由于原代培养细胞和体内细胞性状相似性大，是检测药物很好的实验对象。 ;（2）传代期　　初代培养细胞一经传代后便改称做细胞系（Cell Line）。在全生命期中此期的持续时间最长。在培养条件较好情况下，细胞增殖旺盛，并能维持二倍体核型，呈二倍体核型的细胞称二倍体细胞系（Diploid Cell Line）。为保持二倍体细胞性质，细胞应在初代培养期或传代后早期冻存。当前世界上常用细胞均在不出十代内冻存。如不冻存，则需反复传代以维持细胞的适宜密度，以利于生存。但这样就有可能导致细胞失掉二倍体性质或发生转化。一般情况下当传代10～50次左右，细胞增殖逐渐缓慢，以至完全停止，细胞进入第三期。 ;（3）衰退期：　　此期细胞仍然生存，但增殖很慢或不增殖；细胞形态轮廓增强，最后衰退凋亡。在细胞生命期阶段，少数情况下，在以上三期任何一点（多发生在传代末或衰退期），由于某种因素的影响，细胞可能发生自发转化（Spontaneous Transformation）。转化的标志之一是细胞可能获得永生性（Immortality）或恶性性（Malignancy）。细胞永生性也称不死性，即细胞获持久性增殖能力，这样的细胞群体称无限细胞系（Infinite Cell Line），也称连续细胞系（Continuous Cell Line）。无限细胞系的形成主要发生在第二期末，或第三期初阶段。细胞获不死性后，核型大多变成异倍体（Heteroploid）。细胞转化亦可用人工方法诱发，转化后的细胞也可能具有恶性性质。细胞永生性和恶性性非同一性状。;;;Hayflick极限;;;;;二、细胞培养的基本条件 ;;;;;;;;;;;;;;;三、细胞培养的基本方法 ;;;细胞计数 准备计数板： 准备细胞悬液：要求细胞密度不低于104个/ml，若细胞数很少，应将悬液离心（1000r/min,5min）,重悬浮于少量培养液中。消化单层细胞时，务求细胞分散良好，制成单细胞悬液。 加样：取样计数前，应充分混匀细胞悬液。加样时不要溢出盖玻片也不能溢入两侧的玻璃槽内，如果产生上述情况需对计数板冲洗和拭干后重新加样，加样量也不要太少或带气泡。 计数：在显微镜下，用10×物镜观察计数板四角大方格中的细胞数。细胞压中线时只计左侧和上方，不计右侧和下方。 ;细胞记数;（三）原代细胞培养 ;（四）细胞培养中的问题 ;;归纳 过程;;（五）细胞系及其鉴定 ;;3、鉴定指标;;（六）细胞克隆技术 ;细胞克隆技术的方法;（七）培养细胞的染色体 ;2、染色体测定项目;3、具体操作步骤;;;;;（八）培养细胞的污染与检测 ;1、细胞污染的种类和判定 ;2、污染物的检测 ;;;;;;;;;3、支原体检测方法和处理 ;;4、病毒检测 ;（九）细胞冻存、复苏、运输;;2.复苏;(3)细胞能否顺利复苏，影响因素较多，如冻存时细胞的状态以及有无污染等。目前，有学者介绍还应注意一点，即 细胞溶解后，可缓慢加入10倍冻存液的应用液培养12－48h，再换液。目的是逐渐稀释细胞和保护剂，避免细胞膜内外渗透压变化过于迅速而使部分细胞死亡;3.细胞的运输 ;四、细胞培养的应用;1、测试药物效应 适用于研究抗癌药物和致畸、致癌、致突