[农学]第四章蛋白质的共价结构.ppt

肽键 肽键中的C-N键具有部分双键性质，不能自由旋转。 在大多数情况下，以反式结构存在。 肽键的特点是氮原子上的孤对电子与羰基具有明显的共轭作用。 组成肽键的原子处于同一平面。 蛋白质的一级结构(Primary structure)包括组成蛋白质的多肽链数目。多肽链的氨基酸顺序，以及多肽链内或链间二硫键的数目和位置。其中最重要的是多肽链的氨基酸顺序，它是蛋白质生物功能的基础。 1. 样品必需纯（97%以上）； 2. 知道蛋白质的分子量，其误差允许在10%左右； 3. 知道蛋白质由几个亚基组成； 4. 测定蛋白质的氨基酸组成；并根据分子量计算每种氨基酸的个数。 5. 测定水解液中的氨量，计算酰胺的含量。 (1)测定蛋白质分子中多肽链的数目。 通过测定末端氨基酸残基的摩尔数与蛋白质分子量之间的关系，即可确定多肽链的数目。 (2)多肽链的拆分。 由多条多肽链组成的蛋白质分子，必须先进行拆分。 可以通过加入盐酸胍方法解离多肽链之间的非共价力；应用过甲酸氧化法或巯基还原法拆分多肽链间的二硫键。 (3)二硫键的断裂 几条多肽链通过二硫键交联在一起。可在可用8mol/L尿素或6mol/L盐酸胍存在下，用过量的?-巯基乙醇处理，使二硫键还原为巯基，然后用烷基化试剂保护生成的巯基，以防止它重新被氧化。 (4)测定每条多肽链的氨基酸组成，并计算出氨基酸成分的分子比； (5)分析多肽链的N-末端和C-末端。 (6)多肽链断裂成多个肽段，可采用两种或多种不同的断裂方法将多肽样品断裂成两套或多套肽段或肽碎片，并将其分离开来。 (7)测定每个肽段的氨基酸顺序。 (8)确定肽段在多肽链中的次序。 利用两套或多套肽段的氨基酸顺序彼此间的交错重叠，拼凑出整条多肽链的氨基酸顺序。 (9)确定原多肽链中二硫键的位置。 N末端和C末端氨基酸残基的测定 多肽链端基氨基酸分为两类：N-端氨基酸(amino-terminal)和C-端氨基酸。 在肽链氨基酸顺序分析中，最重要的是N-端氨基酸分析法。 1. N末端氨基酸的分析方法 （1）二硝基氟苯法（DNFB) 由于DNFB与氨基酸中?-氨基形成的键对酸 水解稳定性远比肽键高，因此DNP-多肽经酸水 解后，只有N-末端氨基酸为黄色DNP-氨基酸衍 生物，其余的都是游离氨基酸，用纸层析可以 鉴别氨基酸。 （3）苯异硫氰法（PITC) 多肽或蛋白质的末端氨基酸的N-末端氨基与 PITC作用，生成PTC-多肽。在酸性有机溶液中加 热，N末端的PTC-氨基酸发生环化，生成苯乙内 酰硫脲的衍生物并从肽链上掉下来，用薄层层析 法鉴定。 2. C末端测定方法 （1）肼解法 肼解法是多肽链C-端氨基酸分析法。多肽与肼在无水条件下加热，C-端氨基酸即从肽链上解离出来，其余的氨基酸则变成肼化物。肼化物能够与苯甲醛缩合成不溶于水的物质而与C-端氨基酸分离。 （2）还原法： 肽链C末端氨基酸可以用硼氢化锂还原成相 应的α-氨基醇，用薄层层析法鉴定。 （3）羧肽酶法： 该酶可以专一从肽链的C-末端开始逐个水解 氨基酸，被释放的氨基酸数目与种类随时间而变 化。 羧肽酶是一种肽链外切酶，它能从多肽链的C-端逐个的水解。根基不同的反应时间测出酶水解所释放出的氨基酸种类和数量，从而知道蛋白质的C-末端残基顺序。 目前常用的羧肽酶有四种：A,B,C和Y；A和B来自胰脏；C来自柑桔叶；Y来自面包酵母。 羧肽酶A能水解除Pro,Arg和Lys以外的所有C-末端氨基酸残基；B只能水解Arg和Lys为C-末端残基的肽键。 由几条肽链构成的蛋白质分子，有两种情况，一种是 几条多肽链借助非共价键连接起来的，如：血红蛋白； 另一种是几条多肽链通过共价键交连在一起，如：胰岛 素。如果肽链之间由二硫键交联，或者虽然蛋白质分子 由一条肽链构成，但是链内有二硫键，必须切断二硫 键。 采用β-巯基乙醇处理（pH8?9,室温下放置数小时）, 可以使-S-S-定量还原为-SH。然后用碘乙酸保护-SH， 防止发生氧化。 由几条多肽链构成的蛋白质分子存在两种形式： 1. 几条多肽链借助非共价键连接在一起，称为寡聚蛋白质，如，血红蛋白为四聚体，烯醇化酶为二聚体；可用8mol/L尿素或6mol/L盐酸胍处理，即可分开多肽链(亚基). 2. 几条多肽链通过二硫键交联在一起。可在可用8mol/L尿素或6mol/L盐酸胍存在下，用过量的?-巯基乙醇处理，使二硫键还原为巯基，然后用烷基化试剂保护生成的巯基，以防止它重新被氧化。 氨基酸组成的分析 酶解法: 胰蛋白酶，糜蛋白酶，胃蛋白酶，嗜热菌蛋白酶，羧肽酶和氨肽酶 化学裂解法： 溴化氰水解法 羟胺断裂法 1. 酶裂解法： 常用的酶有：胰蛋白酶、糜蛋白酶、 胃蛋白酶和嗜热菌蛋白酶。 Tr