微生物 菌种分离、驯化.doc

保罗微生物发酵饲料高效复合降解菌的分离、驯化 1.天然菌种的分离纯化 1.1天然菌种的获得 取健康动物（猪、牛、羊）及水产品鱼虾的新鲜排泄物，分别投入生理盐水中制成菌悬液，用稀释平板法进行分离。分离培养时细菌用牛肉膏蛋白胨培养基，37℃培养1～228℃培养3～528℃培养3～4[1]。在平板上分离得到的菌株中选择较大、健壮、饱满的菌落，采用平板划线法继续纯化，直到在线条较疏处出现单个菌落。 1.2菌种初筛 由于饲料中含有大量的蛋白质、淀粉、纤维素等有机物质，这些是动物营养物的主要来源，为了使动物有效利用饲料，本实验从分纯所得菌中以能够高效降解蛋白质、淀粉、纤维素、木聚糖、葡聚糖、植酸、油脂的细菌、真菌菌株为目标菌株，利用菌的生理生化特性对分纯所得菌株进行初筛。 筛选时分别用淀粉水解培养基、明胶培养基、油脂水解培养基、赫氏（Dubos）纤维菌基础培养基、桑塔氏培养基、BPY琼脂培养基、YEPD固体培养基、 2菌种驯化 2.1分解发酵能力驯化 本实验采用在选择性培养基上测溶解圈的方式来驯化初筛所得优势菌群，以提高对饲料原料降解的能力和降解性能。 2.2发酵饲料适口性驯化 同时对各菌种发酵产物的气味进行感官检定，有恶臭、或其他不良气味的舍去。 2.3食品营养学、毒理学驯化 采用异常毒性试验方法，制品2g加入8mL灭菌生理氯化钠溶液中，用体重18-22g健康小鼠5只，每只经口灌胃0.5mL，每天一次，连续3天。从第一天灌胃起，连续观察7天，小鼠应健康活存，体重增加，判为合格。如不符合上述规定，则该菌株舍弃。 3复配菌种效果检测 3.1产酶能力测定 将以上研究所得菌种分别测定在特定底物发酵过程中的产酶酶活。确定各菌株产酶能力。补充酶活测定方法（GB？） 3.2饲喂效果测定 将以上研究所得的高效复合降解菌参考国外微生物饲料淀粉酶、蛋白酶、纤维素酶等的酶活比例投放到饲料中，饲料配方、每餐饲喂量由畜牧专家提供。 具体饲喂情况见下表。 不同品种饲喂情况 4、结果与讨论 4.1菌种分离结果 分纯共得到繁殖能力、降解能力、适应能力都较好的菌株细菌137株、真菌63株。 4.2菌种初筛结果 将分纯所得菌株经过大量生理生化实验初筛得到： 可高效降解淀粉的细菌有10株，真菌4株；蛋白质降解菌中细菌有9株，真菌6株；油脂降解菌中细菌有5株，真菌9株；纤维素降解菌中细菌有4株，真菌8株； 最后共筛选出高效降解菌株有细菌24株，真菌13株。 4.3菌种驯化结果 将初筛选所得的所有菌通过产酶能力、饲喂适口性、营养学、毒理学驯化得细菌20株，真菌12株。选定生产用菌株细菌5株，真菌3株。其他菌株作为公司将来继续深入研究的资源菌株。 表2 高效降解菌株及形态特征（细菌） 菌株编号 菌株颜色 菌落形态 革兰氏染色 X1 乳白色 圆形，形大，表面湿润，粘性，半透明 — X2 浅橙色 圆形，形小，表面湿润，粘性，不透明 + X3 土黄色 圆形，形小，表面湿润，粘性，不透明 + X4 白色 圆形，形较大，表面干燥，边缘皱起，粘性，不透明 + X5 乳白色 圆形，形较大，表面湿润，不透明 — 日X4 白色 圆形，形较大，表面干燥，不透明 — 日X5 浅黄色 圆形，形较大，表面干燥，边缘皱起，不透明 + 日X6 无色 圆形，形小，表面湿润，透明 — 日X10 白色 圆形，形较大，表面湿润，粘性，不透明 + 日X22 黄白色 圆形，形大，表面湿润，粘性，不透明 — 表3 高效降解菌株及形态特征（真菌） 菌株编号 菌株颜色 菌落形态 F3 灰色 圆形，形较小，干燥，不透明，表面有水珠 F8 浅橘色 圆形，形较小，干燥，不透明 F11 白色 圆形，形小，干燥，不透明 日F23 浅灰色 圆形，形较小，干燥，不透明，表面有水珠 M1 深绿色 圆形，形大，干燥，表面毛绒状，菌落厚 M2 黄色 圆形，形很大，干燥，表面粉末状，有凹凸，菌落厚 M3 灰黑色 圆形，形很大，干燥，表面粉末状，菌落厚 M4 白色 不规则，长在其他菌落周围，干燥，菌落薄 日M1 棕色 圆形，形大，干燥，表面粉末状，菌落厚 日M4 棕黄色 圆形，形大，干燥，表面粉末状，菌落厚 日M5 灰色 菌落不规则，成片生长，表面干燥，有很长丝毛状 日M6 棕红色 圆形，形较大，干燥，表面粉末状，菌落厚 日M8 砖红色 圆形，形较大，干燥，表面粉末状，菌落厚 日M11 黑色 圆形，形大，干燥，表面毛绒状，菌落厚 注：革兰氏染色为阳性用“+”表示，阴性用“—”表示。 根据菌落形态，及发酵生理生化反应，以上菌种分别为： 以上菌种正在进行菌株鉴定及菌株专利保存申办工作