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第九章 载体 第九章 载 体 第三节 酵母质粒/courseware/03_04jiyingongcheng/web/chap03/chap03_5.htm 一、酵母2μ质粒的生物学特性 1. 概述 大多数酵母菌株含有一种称之为2μ的质粒 基本结构： ①它们是封闭环状的双链DNA分子，周长约2μ(6kb左右)，以高拷贝数存在于酵母细胞中，每个单倍体基因组含60-100个拷贝，约占酵母细胞总DNA的30％； ②各含约600bp长的一对反向重复序列； ③由于反向重复序列之间的相互重组，使2μ质粒在细胞内以两种异构体(A和B)形式存在； ④该质粒只携带与复制和重组有关的4个蛋白质基因(REP1、REP2、REP3和FLP)，不赋予宿主任何遗传表型，属隐蔽性质粒。 图3-7 酵母2μ质粒的结构和限制性图谱 A和B是两种构型的2μ质粒，图谱的环状部分代表单一顺序，直线部分代表反向重复序列（IR），粗线条表示复制原点，REP1、REP2和REP3分别代表复制酶基因和顺式作用位点，FLP表示重组酶基因，图谱上标明了根据这个质粒的全核苷酸顺序确定的一套限制性位点的位置。（引自 J.R. Broach, 1983） 2μDNA结构上最显著的特点是存在两个反向重复序列(inverted repeat，IR)，它们被一个较大的单一顺序区(约2.7kb)和一个较小的单一顺序区(约2.3kb)隔开。在酵母细胞中，由于这个反向重复序列之间的相互重组，使2μ质粒群成为两种构型(A和B)的混合物，它们之间的差别仅表现在两个单一顺序区的相对方向不同。 这类质粒至少在细胞周期的某一时期是位于酵母核内 2μDNA和染色体DNA一样与组蛋白一起装配成核小体结构； 2μDNA的复制只发生在细胞周期的s期，并且每个分子在一个细胞周期中一般只复制一次； 它和核DNA的复制都受到同样一些核基因的控制等。 尽管2μ质粒位于核质中，但游离的2μDNA从不整合到染色体中去。 2. 2μ质粒DNA的核苷酸顺序 酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的 2μ质粒 全长6318bp，有61％是(A+T)，酵母染色体DNA(64％) ，但线粒体DNA (79％) 。 2μ质粒DNA含有两个反向重复序列区域(IR1和IR2)，每个区域长599bp。 三个很长的空位译读码（open reading frame, ORF），其中两个(REP2和FLP)在较小的单一顺序区，另一个(REP1)在较大的单一顺序区。 3． 2μ质粒的复制系统 2μ质粒DNA有一个高效的复制原点，它已被定位在这个质粒的一个约350bp长的片段(A型质粒：3650－4000；B型质粒：650－1000)； 其主要部分是IR1的Xba I切点一侧富合对称顺序的区域，并且有约100bp长的一段原点顺序从IR1一直延伸到邻近的单一顺序区 质粒在酵母细胞内稳定地增殖和维持其高拷贝数还需要由质粒本身编码的两个蛋白质REP1和REP2，是反式作用位点。及单一顺序区中HpaⅠ切点附近的顺式作用位点REP3。 4．FLP重组酶和2μ质粒的分子内重组 酵母2μ质粒DNA的反向重复序列(IR)很容易发生重组。这种有效的重组是由2μ质粒基因组自身编码的一种FLP蛋白质催化的。 2μ质粒的重组是真核细胞内一类具有位置专一性的重组。 基因FLP “结合部位”：一对位于IR顺序中的能被FLP蛋白质识别的，范围在反向重复序列的XbaI切点两侧约65bp的一个较小区域。 2μ质粒的FLP基因最近已被克隆在酵母和大肠杆菌的表达型质粒载体中。可以直接制备FLP蛋白质。这种FLP蛋白质可以有效地引起2μ质粒DNA的重组，因此被称为FLP重组酶。 结合部位芯子区：一旦核苷酸顺序发生突变(例如XbaⅠ位点中的突变)，能剧烈损害底物DNA的重组。 二、酵母质粒DNA的制备和纯化 一般通过大肠杆菌来制备和纯化酵母质粒DNA。 1、先提取酵母菌中的质粒DNA ：取1.5mL对数生长晚期的培养液，13,000r/min离心15s,悬浮于100ul TE缓冲液。加200ul裂解液(2%Triton X-100; 1%p SDS; 0.1mol/L NaCI;10mmol Tris HCL pH8; 1 mmol EDTA), 200 ul苯酚/氯仿/异戊醇，300mg石英砂(0.5一l mm )。振荡2min, 13,000r/min离心5 min。乙醇沉淀，加TE缓冲液。 2、将上述提取获得的酵母质粒DNA转化大肠杆菌 3、从大肠杆菌中进行酵母质粒DNA的制备和纯化。 三、酵母质粒载体 以大肠杆菌质粒为基本骨架 具有酵母的DNA复制起始区、选择标记、有丝分裂稳定区和外源D