细菌内毒素和热原检查法培训.ppt

细菌内毒素和热原检查法 郝树彬 基础知识 热原：注入人体后可引起发热反应的物质。 热原的检查方法 体内热原检查法——兔温法（PT) ——是一种体内的、全热原的检查方法。1942年USP12版第一次收载。各国药典至今仍在使用。 体外热原检查法（ITP) ——是一种体外的利用人血细胞反应的全热原检查法。尚未有药典收载，欧洲药典将会收载。 细菌内毒素检查法（BET) ——医药工业普遍接受控制内毒素等于控制热原。 热原分类——按检查法分 内毒素热原 ——革兰氏阴性细菌细胞壁的组分 非内毒素热原 ——除内毒素外的热原 细菌内毒素生物活性 致热性 致死性 引起血液白细胞中的粒细胞下降 激活凝血系统 血压下降 诱导机体对内毒素的耐受 引起淋巴细胞的有丝分裂 诱导抗感染的非特异性 杀死肿瘤细胞 与鲎试剂反应 实验原理 实验试剂 细菌内毒素国家标准品：系自大肠杆菌提取精制得到的内毒素，单位：EU. 用于标定细菌内毒素工作标准品和标定，仲裁鲎试剂灵敏度。 细菌内毒素工作标准品：以细菌内毒素国家标准品为基准进行标定，确定其效价。具备均一性和稳定性。 试剂 75%乙醇、蒸馏水、铬酸洗液。 操作方法 试验准备 洗液的配备　配制铬酸洗液或其他适宜的细菌内毒素灭活剂。 玻璃器皿的洗涤　将洗涤的玻璃器皿用洗涤剂和自来水洗净并空干水分后置洗液中浸泡4小时，取出，用自来水将残余的洗液洗净，再用新鲜蒸馏水冲洗干燥后置适宜的密闭金属容器中，置烤箱。 除去玻璃器皿表面可能存在的外源性内毒素，　玻璃器皿置箱后将烤箱调至180℃，待烤箱温度升到设定的温度后开始记时，须干烤至少2小时。达到时间后，关断电源。待烤箱温度自然降至室温，在不开启金属容器的情况下，可两周内使用，否则须再次加热除去可能存在的外源性内毒素。塑料制品清洗干净后在30％双氧水中浸泡4 h，再用无热原水充分冲洗后在60℃烘箱中烘干备用 。 鲎试剂灵敏度复核 内毒素标准溶液的制备 　取NSE或WSE一支，轻弹瓶壁，使粉末落入瓶底，再用砂轮在瓶颈上部轻轻划痕，75%酒精棉球擦拭后启开，防止玻璃屑落入瓶内。 　按标准品使用说明书用移液管加入规定量的BET水溶解其内容物，用封口膜将瓶口封严。置旋涡混合器上混合15分钟，然后制备成所需浓度的细菌内毒素标准溶液即2.0λ、1.0 λ,0.5 λ, 0.25λ（λ为所复核鲎试剂的标示灵敏度），每稀释一步均应在旋涡混合器上混合30秒（详细过程请参见使用说明书）。 示例 例如使用NSE(内毒素含量为9000EU/支)时的方法如下： 溶解：准确吸取BET水1ml加入NSE的安瓿内，用封口膜　将瓶口封严，置旋涡混合器混合15分钟，即为9000EU/ml内毒素标准溶液。 稀释：取0.3ml内毒素标准溶液加上2.7ml BET水即为1→10稀释液，得到900EU/ml内毒素标准溶液。 9000EU/ml →　900EU/ml → 90EU/ml → 9EU/ml → 1EU/ml → 0.5EU/ml → 0.25EU/ml → 0.125EU/ml → 0.0625EU/ml 在上述稀释过程中，每稀释一步，均须旋涡混合器上混合30秒钟。 待复核鲎试剂的准备 在制备内毒素标准溶液的同时，取0.1ml/支的鲎试剂18支轻弹瓶壁，使粉末落入瓶底。用砂轮在瓶颈处轻轻划痕，75%乙醇棉球擦拭后启开备用，加入0.1mlBET水，使鲎试剂充分溶解，避免产生气泡。  若待复核鲎试剂的规格不是0.1ml/支时，按标示量加入BET水溶解，将溶解后的鲎试剂溶液混匀后每0.1ml分配到10×75mm凝聚管中，要求至少分配18管备用。 加样 加样结束后，用封口膜封口，轻轻混匀，避免产生气泡，连同试管架放入37摄氏度水浴中，试管架保持水平状态，保温60±2分钟. 鲎试剂灵敏度复核 如最大2.0λ浓度管均为阳性，最低浓度0.25λ4管均为阴性，阴性对照为阴性， 结果记录 举例计算 举例计算 ∑X=﹣2.10721 λс=lg-1(-2.10721/4)=0.297 测定值在标示值的50%——200%之间，所标示灵敏度可被确认，此批鲎试剂可用于供试品的细菌内毒素检查。 供试品细菌内毒素的检查 内毒素限值的确定 一次性使用输液器内毒素限值为20EU/套（GB/T14233.2-2005) 供试品细菌内毒素的检查 供试品溶液的制备 每批输液器取3套，管内腔注入细菌内毒素检查用水10mL，反复荡洗5次后，两端封闭，置37℃ 下 2h，将腔内的液体倒入一无菌无热原玻璃容 器内。 试剂制备 举例：所用鲎试剂标示灵敏度为0.25EU/ml,则阳性对照溶液的细菌内毒素浓度为0.5EU/ml. 阳性对照溶液的制备　用细菌内毒素检查用水