细菌活的非可培养状态.ppt

细菌“活的非可培养状态”研究进展 Progress on Viable but non-culturable state of bacteria (VBNC) 定义： 1982年提出 即细菌处于不良环境条件下，细胞通常缩小为球形，用常规方法培养不能生长繁殖，但仍然具有代谢活性，是细菌的一种特殊存在形式 处于该状态的病原菌，一定条件下可以复苏，并具有潜在的致病性 研究现状： 存在VBNC状态的细菌种类及相关诱导因素 细菌VBNC状态的生物学特性 VBNC细菌的复苏 VBNC病原菌的致病性 VBNC细菌的检测方法 细菌VBNC状态的意义 续 表1 部分已报道的进入非可培养状态的细菌种类及与之相关的诱导因素 至今为止共计40多种细菌进入“活的非可培养状态”的报道 基本全部为与人类关系密切的致病菌 与VBNC状态相关的诱导因素 理化因素 温度 低温：霍乱弧菌、创伤弧菌 4~6℃ 高温：空肠弯曲菌 30℃ 、大肠杆菌 25℃ 营养盐缺乏 添加营养盐到培养基中并一定增强细菌的活性或可培养能力，甚至可使其可培养能力加速降低。 创伤弧菌在营养盐丰富培养基中低温培养同样也会进入VBNC状态 续 与VBNC状态相关的诱导因素 理化因素 可见光、紫外线 盐度、渗透压 对多数肠道菌的生存影响较大 氧胁迫 eg. 空肠弯曲菌在振荡条件下易进入VBNC状态 重金属、消毒剂等 续 与VBNC状态相关的因素 生物因素 可能具有一定的保护作用 使细菌从VBNC状态复苏 降低细菌进入VBNC状态的比例 保护细菌不受某些消毒处理的影响 细菌VBNC状态的生物学特性 形态 多数G-菌体积变小，缩成球状 某些G+菌体伸长 生理生化 核酸物质密度降低 细胞质浓缩 蛋白质总量下降 营养盐转运、呼吸速率下降 续 细菌VBNC状态的生物学特性 生理生化 对某些胁迫的抗性增强 细胞膜结构完整但不对称 脂质总量下降 主要膜脂含量下降，某些短链、长链脂肪酸含量增加 合成一些新蛋白 细胞壁肽聚糖交联程度增大 膜势能降低，ATP浓度降低 VBNC细菌的复苏 如果VBNC应答确实是细菌的一种存活机制 ，那么从该状态复苏的能力也应该是必要的 在实验室条件下，目前没有可使所有VBNC细菌都能复苏的报道 进入VBNC状态越久，复苏可能性越小 已报道的可使VBNC细菌复苏的条件 直接逆转不利条件 培养温度恢复正常 添加营养盐 添加渗透压保护剂 将VBNC细菌转入宿主体内、或与宿主共培养 注射至兔肠结扎段中，继续培养一段时间 许兵、徐怀恕等 注射至自愿者体内 Colwell等 对VBNC细菌复苏的争议 Jiang等认为VBNC细菌的复苏可能只是一些活细胞的重新生长造成 一些学者通过系列稀释试验、可培养细菌出现的时间、添加营养盐对复苏的影响等综合分析后认为至少某些细菌存在着真正的复苏现象 Ohtomo等添加奈啶酮酸至培养基中，发现大肠杆菌同样能恢复可培养能力，据此认为重新出现的菌落应该是细菌复苏所造成 VBNC病原菌的致病力 细菌进入VBNC状态并不代表失去致病能力 Colwell等证实VBNC霍乱弧菌仍能导致测试人员腹泻、产生霍乱毒素 Saux等检测到VBNC创伤弧菌溶血素mRNA存在 Rahman等检测证实VBNC痢疾志贺菌仍能产生ShT毒素蛋白，对小肠表皮细胞吸附能力仍能维持 并非所有VBNC致病菌都能保持致病力，细菌进入VBNC状态越久，完整性越易受到破坏，进而感染力下降，甚至复苏能力丧失 VBNC细菌的检测方法 光学方法 基于底物吸收能力的检测方法－活菌直接镜检法（DVC） 1979年Kogure首次使用 在细菌培养物中添加少量营养物和DNA合成抑制剂－奈啶酮酸，培养6h后固定，吖啶橙染色,然后荧光显微镜观察,如果细胞伸长则说明其为存活状态 结合单克隆抗体、原位杂交等技术，可用于自然环境中某种特定细菌的检测，灵敏度高，特异性强 续 VBNC细菌的检测方法 光学方法 基于氧化还原能力的检测方法－呼吸检测方法 在培养物中加入INT或CTC等电子受体，它们在细菌新陈代谢作用下被还原，根据氧化态的INT或CTC均为无色，氧化态的分别为紫色和红色的特点实现检测 相对DVC方法优点显著，无论自养或异养细菌，只要有电子传递链，均可被检测 缺点：膜表面INT沉淀可能较难观察，是否所有细菌均能降解CTC还不能确定 续 VBNC细菌的检测方法 光学方法 基于细胞质膜结构完整性的检测－死/活细菌检测试剂盒（LIVE/DEAD baclight bacterial viability kit, Molecular Probes, Inc） 包含两种核酸染料，SYTO9，在480/500nm 波长下呈绿色，死/ 活细胞均能染色；Propid