Ecoli核糖体蛋白质S12依赖链霉素突变抑制1｝N基因表达的分子机制.PDF

遗 传 学报，23(2);158-162,1996 ActaGeneticaSinica E.coli核糖体蛋白质S12依赖链霉素 突变抑制1}N基因表达的分子机制 蒋 欣 翁曼丽 中（国科学院遗传研究所 北京 100101) 摘要 本文利用ICR方法克隆了E.coliT83依赖链霉素(streptomyeindependent,Smd）菌株 中编码突变的核糖体蛋白质S12的rpsLd基因，并进行了DNA序列分析，发现第42位密码 子由编码赖氨酸L（ys,K）的AAA变为编码谷氨酞胺G（in,Q）的CAA。依据Garnier原理 预测了突变对S12蛋白质二级结构形成趋势的影响。结果表明，突变使第42位氨基酸及其 相连肤段的户转折形成趋势明显上升，相邻几个亚结构域 s（ubdomain)的相对位置有所改 变，S12蛋白质分子的整体构象随之改变。进而以核糖体RNA(rRNA）与核糖体蛋白质结构 和功能相互适应为出发点，讨论S12蛋白质Smd突变抑制AN基因表达的分子机制。 关键词 核糖体蛋白质S12,Smd突变，AN基因 基因表达的调控主要在转录层次上进行，但不乏翻译调控的实例。翻译调控是对转 录调控的补充，精细且及时，使基因表达的程度更加适应生物体本身的需要和外界条件的 变化川。核糖体作为翻译遗传密码的唯一场所，不仅是忠实的翻“译官”，而且参与基因表 达的调控。已往的研究表明，无论是在枯草杆菌中还是在大肠杆菌中，某些核糖体蛋白质 的突变会对外源基因的表达产生不同程度的影响[21［。本实验室曾报道在一株E.coliT83 菌株中，核糖体蛋白质S12发生Smd自发突变，使外源基因— A噬菌体早期调节基因 AN的表达受到明显抑制，蛋白质的合成量下降。进一步测定发现AN基因mRNA的合 成却为正常，说明AN基因的表达在翻译层次受阻[3［1。其分子机制尚不甚清楚，值得进一 步研究。 1材料和方法 1.1菌株及载体DNA E.coliJM101,E.coliT83野生型及Smd突变体均为本实验室保存；噬菌体 M13mp19RF型DNA由德国宝灵曼公司提供；质粒pNO1523DNA由美国Wisconsin 大学酶学研究所提供[710 1.2 培养基及世代时间的测定 LB培养基：1.0％蛋白脉、0.5%酵母抽提物、0.5%NaCl;2xYT培养基：1.6％蛋白 陈、1.0%酵母抽提物、0.5%NaCl;H培养基：1.2％蛋白陈、0.8%NaCl。用5NNaOH将 培养基调至pH7.0,151b/sq.in.蒸汽灭菌25分钟。测定世代时间：T83Sm“菌株 国家自然科学基金及中国科学院v}·五》重点科研资助项 目。本文于1994年9月2日收到 2期 蒋 欣等：E.coli核糖体蛋白质S12依赖链霉素突变抑制}N基因表达的分子机制 159 的过液培养物按1.0％的浓度接种到含200pg/mlSm的新鲜LB培养液中，37℃振荡培 养。用A6、在0.1-1.0范围内的取值按下列公式计算世代时间4(1: T；一t（2一t,)／3.321g(az一a；） 其中，乓表示世代时间；t表示测定A65。时的取值时间；。表示t时菌液在650nm的光吸 收值。．在不含Smd的LB培养液中，依同样方法测定野生型T83的乓值。 1.3rps尸基因的克隆及其DNA序列分析 根据已发表的编码野生型S12蛋白质的rpsLs基因及其侧翼序列的DNA顺序1o［] 合成 1对长各为20个碱基的寡核昔酸引物。引物 1:5GCAAAAGCTAAAACC AGGAG3；引物2:5TGGCCTrACTTAACGGAGAA3。用常规PCR方法扩增 T83S澎染色体上的rps尸基因，扩增产物用Klenow酶处理成平端后，克隆到 M13mp19/HindII位点上。以pNO1523上的rpsL基‘因为模板，进行：［一，zP]dCTP掺 入的随机引物的DNA标记反应，其产物作为Southern印迹杂交的探针筛选阳性克隆。 用荧光标记法测定rpsLd基因的DNA序列。 1.4 核糖体蛋白质S12二级结构形成趋势的预测 在计算机辅助下，依据Gamier预测球状蛋白质二级结构形成趋势的原理181，对野生 型及Smd突变的S12蛋白质的二级结构分别作了预测，并比较两者的差异。 2 结果