分子克隆常用技术简介（核酸纯化浓缩电泳和DNARNA的定量）.PDF

分子克隆常用技术简介（核酸纯化、浓缩、电泳和DNA 、RNA 的定量） 一、核酸的纯化 在分子克隆的所有操作中，最基本的操作是核酸的纯化。其关键步骤是去蛋白质， 通常只要用酚/氯仿。氯仿抽提核酸的溶液即可。每当需要把克隆有某一些所用的酶 灭活或去除以便进行下一步时，可进行这种抽提。然而，如要从细胞裂解液等复杂 的分子混合物中纯化核酸，则要先用某些蛋白水解酶消化大部分蛋白质后，再用有 机溶剂抽提。这些广谱的蛋白酶包括链霉蛋白酶及蛋白酶K 等，它们对多种天然蛋 白均有活性，（1）用酚氯仿抽提：这两种有机溶剂合用，比单独用酚抽提的除蛋白 效果更佳。继而用氯仿抽提则可除去核酸制品中的痕量酚。①核酸样品置有盖小离 心管中，加入等体积的酚/氯仿。②旋涡混匀管内容物，使呈乳状。 ③12000×g 室温 离心15 秒。④水相移入另一离心管，弃去两相界面和有机相。⑤重复步骤①－④步 操作，直至两相界面上见不到蛋白质为止⑦按下述核酸浓缩法沉淀回收核酸。 二、核酸的浓缩 应用最广的核酸浓缩法是乙醇沉淀法。在中等浓度单价阳离子存在下，加入一定量 的乙醇后，所形成有核酸沉淀可经离心而回收，甚至对低至pg 量的DNA 或RNA ， 也可定量回收。回收的核酸可按所需浓度，再溶于适当的缓冲液中。 具体操作时，可向含样品的小离心管中加入V/10 单价阳离子盐贮存液2V 无水乙醇， 混匀，放冰水浴中15－30min，取出目测平衡，0 －4 度，12000g，离心10min。吸 弃上清，再另70%乙醇0.5 －1ml，12000g，0 －4 度洗涤离心2min 。吸弃上清，沉 淀用油泵抽干或打开盖子晾干后，溶于适当体积的缓冲液中。 单价阳离子盐溶液 *：当加醋酸铵时，需加入DNA 液的V/2 。 单价阳离子盐的选择，主要基于下述考虑：用醋酸铵可减少dNTP 的共沉淀，但在 以后要作核酸的磷酸化时应避免用醋酸铵，因铵离子是T，多核苷酸激酶的强烈抑 制剂。当用较高浓度的乙醇沉淀RNA 时，常用LiCl ，因LiCl 在乙醇中溶解度很高， 不随核酸共沉淀。含有SDS 的核酸样品，应使用NaCl ，这时该去垢剂要70%乙醇 中仍保持可溶。DNA 和RNA 沉淀，大多使用醋酸钠（pH5.2 ）。 三、DNA 、RNA 的定量 准确的方法是紫外分光光度法。但本法要求核酸样品是纯净的（即无显著的蛋白质、 酚、琼脂糖或其它核酸、核苷酸等污染物的制品）。用紫外分光光度计测定260nm 和280nm 两个波长处的光吸收，然后，按IA260 相当于50µg/ml 双链DNA 。40µg/ ml 单链DNA 或RNA 及20µg/ml 单链寡核苷酸。计算你的样品含量。260nm 和280 nm 两处读数的比值（A260/A280 ），可反映核酸的纯度。DNA 和RNA 纯品的A26 0 /A280 的值分别为1.8 和2.0 如果样品中有蛋白质或酚的污染，则A260/A280 将明 显低于此值，此时就无法对样品中的核酸进行精确定量。可将样品纯化后再作定量 测定。有丰富实验室经验的人，仅凭样品电泳后溴化乙锭染色萤光带的强度，即可 大致判断出样品中的核酸含量，故他们常不作核酸的紫外分光光度法定量。 四、核酸的凝胶电泳和分子量参照物 （一）琼脂糖凝胶电泳 可用于分离、鉴定和提纯DNA 片段。本法操作简单、迅速，能分辨其它方法不能 分开的DNA 片段混合物，分开的DNA 可用低浓度的萤光染料（0.5µg/ml 溴化乙锭） 染色，在紫外灯下直接观察检测少至1ng 的DNA 。 DNA 通过琼脂糖凝胶的迁移率取决于以下参数：①DNA 分子的大小：线奖双链D NA 分子通过凝胶的速率与其分子量的常用对数成反比。据此用已知分子量的标准 物质和待测分子量的DNA 片段同时电泳，比较其电泳速率，即可求出待测片段的 分子大小。②琼脂糖浓度：给定大小的DNA 片段，以不同速度通过不同浓度的琼 脂扩凝胶。因此利用不同浓度的凝胶，可分辨范围广泛，大小不同的DNA 片段 不同浓度琼脂糖凝胶的分离范围 浓度% （w/v ） 分离线状DNA 分子的有关范围（Kb) 0.3 5-60 0.6 1-20 0.7 0.8-10 0.9 0.5-7