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江南大学医药学院 沉淀技术 概念和分类 盐析 有机溶剂沉淀 等电点沉淀 其他沉淀技术 应用实例 1 概念和分类 概念 溶液中溶质由液相变成固相析出的过程。 本质 通过改变条件使胶粒发生聚结，降低其在液相中的溶解度，增加了固相中的分配率。 作用 分离、澄清、浓缩、保存 沉淀方法分类 盐析 有机溶剂沉淀 等电点沉淀 非离子聚合物沉淀 其他沉淀技术 2 盐析 2.1 原理 “盐溶” 低浓度中性盐离子对蛋白质分子表面极性基团及水活度的影响，增加蛋白质与溶剂相互作用力，使其溶解度增大。 “盐析” 中性盐浓度增加至一定值时，水分子定向排列，活度大大减少，蛋白质表面电荷被中和，水膜被破坏，从而聚集沉淀。 影响盐析的因素 盐离子种类和浓度 生物分子种类和浓度 pH值 温度 2.2 公式和讨论 纯蛋白质有盐析经验公式： log S = β－kS×I S－蛋白质溶解度（g/L）； β－I=0时log S，它取决于盐和Pr的性质，温 度，pH； kS－盐析常数，决定于加入盐性质及Pr性质； I－盐浓度（mol/L） 单纯Pr的盐析 kS·I的变化 盐、Pr一定，kS值一定，I 增加则S减小 降低β β与Pr、温度、pH有关 pH：在Pr的pI时其溶解度较小 温度：在保证Pr不变性的条件下，温度升 高β下降利于盐析。 3．原始浓度P P小，盐析所需I高；P大，盐析所需I低 对混合Pr的盐析，P大，会发生严重共沉作用，一般控制浓度为2.5～3%。 混合Pr的盐析 合适盐析范围的选择 不同Pr盐析峰有重叠，须权衡纯度回收率。 改变原始浓度 一种蛋白质的不同浓度的沉淀曲线会变化 二次盐析 在原盐浓度下二次盐析，可除去易溶杂质，但不能除去难溶杂质。 2.3 盐析操作要点 2.3.1 盐的种类及选择 可使用的中性盐有：(NH4)2SO4、Na2SO4、MgSO4、NaCl NaAc Na3PO4、柠檬酸钠等 以(NH4)2SO4 Na2SO4最广泛，前者最受欢迎 2.3.2 盐析范围的确定 可采用盐浓度对蛋白质沉淀量的盐析曲线测得。（从回收率和纯度考虑） 2.3.3 盐的加入方式 固体 缓慢加，防泡沫，要平衡 液体（饱和盐溶液） 要求盐析范围小于50%饱和度 *盐析反应完全需要一定时间，一般硫酸铵全部加完后，应放置30min以上才可进行固-液分离。 确定盐析范围举例 取小样分段盐析，从回收率和纯度考虑来确定范围 2.3.4 Pr的原始浓度 太稀的蛋白质溶液，不仅消耗大量中性盐，对Pr回收也有影响；高浓度可节约盐用量，但须适中，以避免共沉。 2.3.5 盐析操作的其他方法 透析盐析 将Pr溶液盛于透析袋中，放入一定浓度的盐溶液中，由于渗透压的作用，袋中盐浓度连续性变化，使Pr沉淀 特点…… 反抽提法（Back-Extraction） 将包括要分离的Pr在内的多种Pr一起沉淀出来，然后选择适当的递减浓度的硫酸铵来抽提沉淀物。 特点…… 2.3.6 沉淀的再溶解 将沉淀溶于下一步所需的缓冲液（1～2倍） 2.4 脱盐 透析 *容器尽可能大，低温、搅拌、常换液（旋转透析器、连续循环透析器） 超滤 根据所加操作压所用膜平均孔径的不同，可分为微孔过滤、超滤和反渗透。 凝胶过滤层析 此法脱盐时间短，效果好。 3 有机溶剂沉淀 3.1 基本原理 使溶液的介电常数大大降低，从而增加带电粒子自身之间的作用力，易聚集沉淀；介电常数与静电引力的关系，可用库仑公式表示: 争夺酶、蛋白质等物质表面的水分子，破坏水化层，使分子易碰聚产生沉淀。 几种溶剂的介电常数 3.2 特点 优点 分辨能力比盐析高,即一种生物分子或其他溶质只在一个比较窄的有机溶剂浓度范围内沉析；沉析不用脱盐，过滤比较容易。 缺点 是某些具有生物活性的大分子容易引起变性失活，操作需在低温下进行。 3.3 沉淀条件 温度 生物大分子在有机溶剂中对温度敏感，易变性，且有机溶剂与水混合时产生放热反应 有机溶剂必须预先冷至较低温度，一般在0℃以下，操作时要在冰盐浴中进行，加入有机溶剂必须缓慢，并不断搅拌以免局部浓度过浓 温度越低，得到的生物活性物质越多，而且可以减少有机溶剂的挥发 温差分级沉淀 3.3 沉淀条件 pH 尽可能选择样品溶解度最低的pH，通常是选在等电点附近，以提高该沉析的分辨能力 要选择在样品稳定的pH范围内，少数生物分子在等电点附近不稳定，影响其活性 尽量避免目的物与杂质带相反电荷而加剧共沉现象的发生 样品浓度 样品浓度低时增加有机溶剂投入量和损耗，降低了溶质回收率，易产生稀释变性，但共沉的作用小，有利于提高分离效果 对于高浓度的生物样品，节省了有机溶剂，减少了变性的危险，但共沉作用大，分离效果下降 蛋白质0.5％～3％，黏多糖1％～2％ 3.3 沉淀条件 离子