叶绿体色素的提取分离及含量测定.PDF

叶绿体色素的提取、分离 及含量测定 甄 毓 环境科学与工程学院 一、实验目的 1. 掌握叶绿素的提取、分离和定量测定方法。 2. 熟练掌握分光光度计的使用原理及其方法。 二、实验原理 1. 朗伯—比尔定律 某有色溶液的光密度 与其中溶质浓度 和液层厚度 成正比，即： D C L D = kCL 式中： 为比例常数。当溶液浓度以百分浓度为单位，液层厚度为 k 1 cm 时， 为该物质的比吸收系数。各种有色物质溶液在不同波长下的比吸 k 收系数可通过测定已知浓度的纯物质在不同波长下的光密度而求得。 如果溶液中有数种吸光物质，则此混合液在某一波长下的总光密度等于 各组分在相应波长下光密度的总和，这就是光密度的加和性。 2. 叶绿体色素的提取及分离 提取：叶绿体色素不易溶于水而易溶于有机溶剂特性--丙酮、 乙醇等有机溶剂提取。 色素分离：纸层析法分离。吸附剂对不同物质的吸附力不 同，当用适当的溶剂推动时，混合物中各成分在两相（流动 相和固定相）间具有不同的分配系数，所以它们的移动速度 不同，经过一定时间层析后，便将混合色素分离。 3. 定量测定 测定叶绿体色素混合提取液中叶绿素a、b和类胡 萝卜素的含量，只需测定该提取液在三个特定波 长下的光密度D ，并根据叶绿素a、b及类胡萝卜 素在该波长下的比吸收系数即可求出其浓度。 以80%丙酮为提取液测定663 nm和645 nm下吸光度即可用下 列公式计算出提取液中各色素的含量。 Ca=12.72D663 - 2.59D645 （1） C =22.88D - 4.67D 2 b 645 663 （） 将C C C 与 相加即得叶绿素总量（ ）： a b T C =C +C =20.2D +8.05D 3 T a b 645 663 （） 在有叶绿素存在的条件下，用分光光度法可同时测定出溶液 中类胡萝卜素的含量。 丙酮提取液中类胡萝卜素的含量：Ck = 4.7D440 - 0.27Ca+b （4 ） 以96%乙醇为提取液测定665 nm、649 nm和470 nm下吸光 度即可用下列公式计算出提取液中各色素的含量。 Ca = 13.95D665 – 6.88D649 （5 ） C = 24.96D – 7.32D 6 b 649 665 （） C = 1000D – 2.05C – 114.8C / 245 7 k （ 470 a b ） （） 三、实验材料 新鲜的菠菜叶片 四、实验步骤 1. 提取叶绿素 研磨法 研磨法 材料剪碎 材料剪碎