[理学]外源基因的原核表达.ppt

基因文库是指包含了一个生物细胞中全部DNA序列的片段与载体连接构成重组DNA分子经转化宿主细胞后所形成的克隆群体。 应用DNA重组技术，可以将各种生物体全部基因的遗传信息，贮存在可以长期保存的稳定重组体中，以备需要时应用。好象将文献资料贮存于图书馆一样，所以称其为genomic library。 基因文库的分类:基因组文库（genomic DNA library）G-库 cDNA文库（cDNA library）C-库 基因组文库：一种生物的基因组DNA文库是包括该种生物全部基因组DNA序列的随机片段的重组ＤＮＡ克隆的群体。每个克隆中含有不同的ＤＮＡ片段，只要有足够的克隆，就会含有一个生物中所有感兴趣的目的DNA片段，就构成了一个基因文库。 基因组DNA文库构建的程序 ①载体DNA的制备； ②高纯度大相对分子质量基因组DNA的提取和大片段的制备； ③高纯度大相对分子质量基因组DNA的部分酶切与脉冲电泳分级分离； ④载体与外源片段的连接与转化或侵染宿主细胞； ⑤重组克隆的挑选和保存。 构建基因组文库的载体系统 按功能载体分： 克隆载体 (cloning vector) 　表达载体 　(expression vector) 构建基因组文库的载体系统 根据插入DNA片段的大小，来选择载体。 基因组文库的构建 克隆原理及基本步骤 1．通过细菌培养增殖载体、回收、纯化载体 2．基因组DNA的制备 3．连接：分别酶切载体与外源DNA ，再连接 4．包装 ?溶原菌株(BHB2688+BHB2690) 5．感染宿主细胞/铺平板 6．筛选某个DNA片段： 嗜菌斑原位杂交 细菌培养与质粒扩增 1. 挑单克隆E.coli菌株接种到斜面培养基上（活化菌种），37℃过夜培养 2. 从斜面培养基上挑E.coli菌株，接种于25毫升液体培养液内（含氨苄青霉素），37℃振荡过夜培养 3. 从中取4毫升种子菌液于含M9培养基中（含Ap），37℃振荡培养3-4小时（OD600＝1.0） 质粒提取 取1.5ml培养物倒入Eppendorf管中，12000r/min，4℃，30sec 吸去培养液，使细胞沉淀尽可能干燥 将细菌沉淀悬浮于100μl预冷的溶液I中，剧烈振荡 加200μL溶液II（新鲜配制），盖紧Eppendorf管，快速颠倒5次，混匀内容物，将Eppendorf管放在冰上 酶切鉴定 10μL溶液 + 10×内切酶缓冲液2μL + 5～10U酶到一Eppendorf管37 ℃，1-2h加2μL的反应中止液。 电泳： 1. 1％Agrose gel的制备 2. 上样 3. 电泳 4. 紫外灯下观察和拍照 克隆原理及基本步骤 1．通过细菌培养增殖载体，回收、纯化载体 2．基因组DNA的制备 3．连接：分别酶切载体与外源DNA ，再连接 4．包装 ?溶原菌株(BHB2688+BHB2690) 5．感染宿主细胞/铺平板 6．筛选某个DNA片段： 嗜菌斑原位杂交 cDNA文库 一、基本概念 cDNA文库是指某一组织中全部的mRNA反转录为cDNA而构建的克隆群体。即某一组织细胞中全部表达的蛋白质的基因文库。 在高度分化的生物体中，不同组织和细胞在不同时段的mRNA种类不同（即基因的表达谱不同）。 三、cDNA文库构建 （一）mRNA的分离纯化 mRNA分离策略是基于真核细胞的mRNA含poly A尾。 用oligo dT从总RNA分离出mRNA。 总RNA的提取关键是防止RNA酶对RNA的降解。 细胞总RNA的提取和mRNA的分离 通常用于构建cDNA的是真核细胞的mRNA，由于cDNA从mRNA合成而来，代表了基因组的可转录部分，不含内含子序列，因此可被用于在大肠杆菌中表达编码蛋白。 由于每类细胞和组织只表达一套特定的基因，因此从特定组织中制备的mRNA通常会富集某些特异序列。所以起始材料的选择十分重要。 1、mRNA的制备: 动物细胞或植物细胞mRNA的制备 2、mRNA的来源: 选用mRNA含量高的组织材料，或通过药物等方法提高mRNA的含量。 3、mRNA完整性的检测 1)mRNA分子的大小： 哺乳动物mRNA长度为500-8000bp，大部分mRNA位于1.5-2.0kb之间. 2)总mRNA指导合成cDNA第一链长分子的能力 4、mRNA在细胞中的丰度 1) 高丰度mRNA 目的mRNA在细胞中的含量占细胞质总mRNA 量的50-90%, 该类mRNA在合成和克隆cDNA之 前不需进一步纯化特定mRNA 。 2) 低丰度mRNA 目的mRNA在细胞中的含量占细胞质总m