[畜牧兽医]第七章+哺乳动物胚胎与配子生物工程技术.ppt

哺乳动物胚胎工程Mammal Embryo Engineering 第一节、胚胎移植（Embryo Transplant） 定义：将良种母畜配种后的早期胚胎取出，移植到同种、生理状态相同的其他母畜体内，使之继续发育成为新个体。 二、胚胎移植的过程及意义 1、充分发挥良种母畜的繁殖潜力。 2、加速品种改良，扩大良种畜群。 3、诱产双胎，提高生产效率。 4、防疫需要和克服不孕。 5、基础研究手段。 6、满足畜牧业现代化的需要。 三、胚胎移植的特点 1、遗传物质来自亲代。 2、营养物质来自受体。 四、胚胎移植的生理学基础和原则 1、母畜发情后生殖器官的孕向发育； 2、早期胚胎呈游离状态； 3、胚胎移植基本上不存在免疫问题； 4、胚胎与供受体的关系。 (二)胚胎移植的基本原则 1、胚胎移植前后所处环境的一致性。 ⑴种属的一致性； ⑵生理的一致性； ⑶收集和移植部位的一致性。 2、胚胎发育的期限 五、胚胎移植的技术过程 供受体的选择； 供体的超排处理与配种和受体的同期发情； 胚胎的收集； 胚胎的检查； 胚胎移植。 (一)供体和受体的选择 供体：良种母畜。 受体：良好的繁殖性能，健康、 体况中上等。 (二)供体超数排卵处理和受体母畜的同期发情 1、超排目的 得到足够量的合格胚胎。 2、超排方法 3、受体母畜的同期发情 与供体母畜超排同时进行。 P4、PGF2a (三)供体母畜的配种 要求：1、优良公畜的精液； 2、精子活率高、密度大且两次配种。 (四)胚胎的收集 1、手术法收集胚胎手术 (五)胚胎的检查 ⑴荧光活体染色体 醋酸荧光素（FDA，fluoresceindiacetate），培养3-6′，活胚胎显示荧光，死胎无荧光。 ⑵测定代谢活性法 1h测定葡萄糖的消耗量2-5μg以上。 ㈥ 胚胎的移植 手术法：各种家畜 非手术法：牛、马 (七)供体和受体的观察 健康状况； 是否发情。 六、胚胎移植目前存在的问题和发展前景。 1、超排效果不够稳定。 2、胚胎回收率低。 3、移植成功率低50-60%. (二)发展前景 1、提高稳定超排效果。 2、改进非手术法收集和移植胚胎 的技术和器具. 3、胚胎移植技术应与胚胎切割、胚胎冷冻、 早期胚胎的性别鉴定等结合起来。 第二节 胚胎冷冻与体外受精 (一)意义 1、建立胚胎库，保存优良种畜与濒危动物资源。 2、使胚胎移植不受时间与地点的限制。 3、胚胎运输取代种畜引进。 (二)冷冻原理 冷冻保护剂：甘油、DMSO、 乙二醇、丙二醇。 (三)冷冻及解冻方法 1、缓慢降温法 以低于0.2-0.8℃/min速度降低到－70℃ 再投入液氮，解冻速度也不超过25℃/min 优点：脱水完全，细胞内不易形成冰晶 缺点：费时，需要特殊仪器 2、快速冷冻，快速解冻 　 3、一步冷冻法 　　　采用25%的甘油、丙二醇、乙二醇中的任何两种保护剂组成高浓度的玻璃化液，分两步移入低、高浓度的保护剂中，装管并在4℃平衡10′然后投入液氮。（DMSO对胚胎的毒性很大） 25℃→25%甘油13′→ 25%甘油、0.25M蔗糖10′→4℃ 25%甘油、25%丙二醇30″→液氮 解冻：胚胎→25℃水温→0.5mol/L蔗糖5′→保存液冲洗3-4→装枪移植。 二、体外受精 (一)卵母细胞体外成熟 1、采卵：剖腹、腹腔镜、屠宰场 卵子分四类 ①形态正常，卵丘细胞致密 ②卵丘细胞部分脱落 ③卵丘细胞全部脱落：裸卵 ④卵子已退化 2、未成熟卵子的培养 ⑴TCM-199+胎牛血清+丙酮酸，可加cAMP、血清、生长因子、生殖激素(FSH、17β-雌二醇，hCG) 39℃ 5%CO2饱和湿度20-30h ⑵M199+PMSG10/ml+hCG10/ml 17β-雌二醇1mg/L 10%猪卵泡液 ⑶10%FSC+半胱氨酸69mg/L (二)精子体外获能 1、精子洗涤：多次离心 2、精子获能