噬菌体的检查及效价测定中国试剂网.PDF

中国试剂网 3.19.1.1 噬菌体的检查及效价测定 1、目的： 1.1 了解噬菌体效价的含义及其测定原理。 1.2 学会检查噬菌体的方法。 1.3 掌握用双层琼脂平板法测定噬菌体效价的操作技能。 2 、原理： 噬菌体是一类专性寄生于细菌和放线菌等微生物的病毒，其个体形态极其微小， 用常规微生物计数法无法测得其数量。当烈性噬菌体侵染细菌后会迅速引起敏感 细菌 裂解，释放出大量子代噬菌体，然后它们再扩散和侵染周围细胞，最终使 含有敏感菌的悬液由混浊逐渐变清，或在含有敏感细菌的平板上出现肉眼可见的 空斑──噬 菌斑。了解噬菌体的特性，快速检查、分离，并进行效价测定，对 在生产和科研工作中防止噬菌体的污染具有重要作用。 检样可以是发酵液、空气、污水、土壤等（至于无法采样而需检查的对象，可以 用无菌水浸湿的棉花涂拭表面作为检查样品）。为了易于分离可先经增殖培养， 使样品中的噬菌体数量增加。 采用生物测定法进行噬菌体检查，约需12h 左右，因而不能及时判断是否有噬菌 体污染。通过快速检查可大致确定是否有噬菌体污染，以采取必要的防治措施。 根 据正常发酵（培养）液离心后菌体沉淀，上清液蛋白含量很少，加热后仍然 清亮；而侵染有噬菌体的发酵（培养）液经离心后其上清液中因含有自裂解菌中 逸出的活 性蛋白，加热后发生蛋白质变性，因而在光线照射下出现丁达尔效应 而不清亮。此法简单、快速，对发酵液污染噬菌体的判断亦较准确。但不适于溶 源性细菌及温合 噬菌体的诊断，对侵染噬菌体较少的一级种子培养液也往往不 适用。 噬菌体的效价即１mL 样品中所含侵染性噬菌体的粒子数。效价的测定一般采用 双层琼脂平板法。由于在含有特异宿主细菌的琼脂平板上，一般一个噬菌体产生 一个 噬菌斑，故可根据一定体积的噬菌体培养液所出现的噬菌斑数，计算出噬 菌体的效价。此法所形成的噬菌斑的形态、大小较一致，且清晰度高，故计数比 较准确，因 而被广泛应用。 3、材料： 中国试剂网 3.19.1.1 3.1 菌种： 敏感指示菌（大肠杆菌）、大肠杆菌噬菌体(从阴沟或粪池污水中分离) 。 3.2 培养基： 二倍肉膏蛋白胨培养液，上层肉膏蛋白胨半固体琼脂培养基（含琼脂 0.7%，试 管分装，每管５mL ），下层肉膏蛋白胨固体琼脂培养基（含琼脂 2% ），1%蛋白 胨水培养基。 3.3 仪器和器具： 无菌的试管、培养皿、三角瓶、移液管（1、5mL ），恒温水浴锅，离心机、721 分光光度计等。 4 、流程： 4.1 噬菌体的检查 4.2 噬菌体效价的测定 5、方法： 5.1 噬菌体的检查： 5.1.1 样品采集 将2～3g 土样或5mL 水样（如阴沟污水）放入灭菌三角瓶中，加入对数生长期 的敏感指示菌（大肠杆菌）菌液3～5mL，再加20mL 二倍肉汤蛋白胨培养液。 5.1.2 增殖培养 30℃振荡培养12～18h, 使噬菌体增殖。 5.1.3 离心分离 将上述培养液以3000rpm 离心15～20min, 取上清液，用pH7.0 ，1%蛋白胨水稀 释至10-2～10-3，用于噬菌体检查及效价测定。 5.1.4 生物测定法 5.1.4.1 双层琼脂平板法 5.1.4.1.1 倒下层琼脂 融化下层培养基，倒平板（约10mL/皿）待用。 5.1.4.1.2 倒上层琼脂 融化上层培养基，待融化的上层培养基冷却至 50℃左右时，每管中加入敏感指 示菌 (大肠杆菌) 菌液0.2mL，待检样品液或上述噬菌体增殖液0.2～0.5mL，混 中国试剂网 3.19.1.1 合后立即倒入上层平板铺平。 5.1.4.1.3 恒温培养 30℃恒温培养6～12h 观察结果。 5.1.4.1.4 观察结果 如有噬菌体，则在双层培养基的上层出现透亮无菌圆形空斑── %26not;%26not;%26not;%26not;噬菌斑。 5.1.4.2 单层琼脂平板法 省略下层培养基，将上层培养基的琼脂量增加至2% ，融化后冷却至45 ℃左右， 如同上法加入指示菌和检样，混合后迅速倒平板。30℃恒温培养