[医学]基因工程生物化学.ppt

DNA复制的酶及蛋白因子 1.底物 dNTP(dATP,dGTP,dCTP,dTTP) 2.聚合酶 DNA聚合酶 （DNA依赖的DNA 聚合酶) DNA--pol 3.模板　单链的DNA母链 4.引物　寡核苷酸引物（RNA) 5.其他酶和蛋白质因子 拓扑异构酶、单链DNA结合蛋白，连接酶 解旋酶、引物酶 多种蛋白因子　　 DNA聚合酶 （DNA polymerase，DNA-pol） —以DNA为模板，催化3，5 -磷酸二酯键的形成 常用的盐溶液 PCR工作原理 是以要扩增的DNA分子为模板，以一对分别与模板5`末端和3`末端相互补的寡核甘酸片段为引物、在4种脱氧核糖核甘酸存在的条件下，依赖DNA聚合酶的酶促合成反应。 PCR特异性取决于人工合成的一对引物和模板DNA结合的特异性。 PCR体系基本组成 模板DNA： （102-5）拷贝 dNTP底物：20—200umol/L，过高将加快反应速度， 同时增加碱基的错误掺入率 特异性引物： 0.1—0.5 umol/L DNA聚合酶： Klenow T4 、 T7聚合酶 TaqDNA聚合酶具有良好的热稳定性。并具有5`-3`聚合酶活性及3`-5`外切酶活性，因此可以校正PCR反应中某些单核甘酸的错配。 含Mg2+的缓冲液： Mg2+ 能影响反应特异性和扩增片段的产率，一般为1.5—2.0mmol/L，过量将增加非特异性条带的产生。 引物设计原则 引物长度15-30bp 引物碱基尽可能随机分布，避免出现嘌呤、嘧啶堆积现象，引物G+C含量宜在45-55%左右。 引物的内部不应形成二级结构，两个引物间不应有互补链存在 引物的碱基顺序不应与非扩增区域有同源性。计算机分析。 引物3`末端碱基原则上与模板配对，3`末端碱基最好不是A。 引物5`末端碱基无严格限制，只要与模板DNA结合的引物长度足够，末端可以游离。因此可以在引物5`末端加上限制性内切酶位点。 PCR产物的检测 琼脂糖凝胶电泳；（EB） 分子杂交； 限制性内切酶酶切分析； 微孔板夹心杂交法； 直接测序 PCR新技术 RT-PCR：用于RNA分析 PCR-SSCP：可用于点突变分析 热启动PCR：可提高特异性。 不对称PCR（asymmetric PCR） 多重PCR(multiplex PCR) 巢式PCR(nested PCR) 核酸分子杂交方法及特点 3．DIG 标记探针的方法 (七) DIG 信号检测 1. 在抗 DIG 抗体上偶联荧光素 用于原位杂交 2. 在抗 DIG 抗体上偶联碱性磷酸酶，以碱性磷酸酶催 化的底物显色反应或化学发光反应检测 DIG 探针的 杂交信号。 (1) 用于显色反应的底物 NBT (氮蓝四唑盐酸盐) BCIP (5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸盐) (2) 用于化学发光反应的底物 AMPPD、CSPD 和 CDP-Star 用荧光素检测杂交信号 抗 DIG 抗体 荧光素 细胞核 染色体 抗 DIG 抗体 用碱性磷酸酶检测杂交信号 碱性磷酸酶 显色反应底物 NBT (氮蓝四唑盐酸盐) BCIP (5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸盐) 化学发光反应底物 AMPPD、CSPD 和 CDP-Star 转基因动物 ? 研究基因的功能 ? 发现人类疾病相关基因 Oncomice 模型 (易患乳腺癌和淋巴癌) AIDS 动物模型 心脏病动物模型 糖尿病动物模型 ? 筛选和测试药物 ? 生产蛋白质药物 转基因羊的乳腺组织作为“生物反应器”(bioreactor) ? 生产抗体 ? 改良动物品种 转基因小鼠 1982, USA ? 为防止单链 RNA 形成空间结构，需用变性的琼脂糖 凝胶即甲醛-琼脂糖凝胶分离 RNA分子。 ? 为防止外源性 RNase 的污染，所用的托盘、梳子、 倒胶槽、电泳槽等需要用焦碳酸二乙酯 (DEPC) 或 H2O2处理；所用的缓冲液要用 DEPC 处理的 ddH2O 来配制。 注意：DEPC是潜在的致癌剂，须小心操作。 RNA 琼脂糖凝胶电泳 1．10X MOPS 电泳缓冲液 200 mM MOPS [3-(吗啉代)-丙磺酸], pH 7.0 50 mM NaAc 10 mM EDTA, pH 8.0 使用前，将 10X MOPS 稀释至 1X MOPS 2．甲醛-琼脂糖凝胶的制备 甲醛的终浓度：7.7％ 3