[医学]第九章 核酸提取和鉴定.ppt

第九章 核酸的提取与鉴定 第一节　核酸提取 一、质粒DNA的提取 第二节　核酸凝胶电泳 第三节　DNA测序 一、Sanger双脱氧链终止法 二、Maxam-Gilbert化学降解法 三、DNA测序自动化 0.2~3 1.5 0.1~2 2.0 0.4~6 1.2 0.5~7 0.9 0.8~10 0.7 1~20 0.6 5~60 0.3 分离DNA的有效范围(Kb) 琼脂糖凝胶浓度(%) 琼脂糖凝胶浓度与分离DNA的有效范围 ⑴加缓冲液 ⑵加热：90度左右 ⒉制胶 ⑶灌胶，插入梳子（冷却40-45度后凝固 ）； ⑷将凝胶置于电泳槽中； ⑸加入电泳缓冲液，拔出梳子 ⒊上样：样品与上样缓冲液混合，加入胶孔中； ⒋接通电源，进行电泳； 上样缓冲液的作用 （监测电泳的进程；增加样品密度） 溴酚蓝 (200bp) 二甲苯青 (1600bp) 1.4%琼脂糖凝胶 ⒌染色： 溴化乙锭：一种荧光染料， 和双链DNA结 合后，在紫外 光照射下发橙 黄色荧光； ⒍检测：紫外透射仪、凝胶呈像分析系统 凝胶电泳的应用 ⒈核酸分子量的检测 ⒉鉴别分子量相同而构型不同的DNA分子 ⒊RNA样品质量的检测 28SrRNA 18SrRNA 二、聚丙烯酰胺凝胶电泳 聚丙烯酰胺凝胶：由丙烯酰胺和N,N`-甲叉双丙烯 酰胺在TEMED和过硫酸铵的催 化下聚合而成。 特点： 凝胶孔径较小； 分辨率高（相差一个bp的DNA）； 适合分离5-500bp的DNA； 聚丙烯酰胺凝胶电泳分类 变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（分离单链DNA） 非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（分离双链DNA） 连续聚丙烯酰胺凝胶电泳 不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳 * 提取核酸的种类： 基因组DNA 质粒DNA 总RNA mRNA 核酸提取的总原则 ⒈保证核酸一级结构的完整性； ⒉防止污染（蛋白质、多糖、有机溶剂等）； ⒊防止核酸降解； 核酸提取的基本步骤 ⒈ 破碎细胞； ⒉ 除去其他生物分子； ⒊ 分离核酸； ⒋ 除去杂质； ⒌ 鉴定和储存 质粒：游离于细菌染色体之外的遗传物质， 特点： 闭环双链DNA 1~300kb 能够复制 质粒DNA提取的基本步骤： ⒈ 培养细菌和扩增质粒 ⒉ 收获细菌和溶菌 ⒊ 提取质粒 ⒈ 培养细菌和扩增质粒 培养条件：37℃，液体培养基中，150-250r/min 的摇床旋转的条件下培养细菌； 为增加质粒拷贝数可加入氯霉素； 生长情况： 大肠杆菌每20min分裂1次，直到最大密度 ⒉ 收获细菌和溶菌 收获细菌：离心收集细菌细胞沉淀 ，弃上清培 养液； 溶菌：破坏细胞壁和细胞膜 机械法：超声波、捣碎机、匀浆器等； 1.溶菌酶：破坏细胞壁 溶菌酶-化学试剂联合法： 3.去污剂：SDS(十二烷基硫酸钠)； Triton X-100（曲拉通X-100）等， 作用：溶解细胞膜。 2.EDTA(乙二胺四乙酸盐)：螯合Ca2+(维持细胞壁 必需) ⒊ 提取质粒:去除染色体DNA 原理： 1.质粒DNA和染色体DNA的分子大小不同： 质粒DNA分子量小 2.质粒DNA和染色体DNA的结构不同： 染色体DNA断裂成线状片断 质粒DNA环状DNA 提取方法： ⑴ 氯化铯密度梯度分离法 方法：细菌裂解液+氯化铯+溴化乙锭（EB） 超速离心 氯化铯密度梯度离心 溴化乙锭（EB）：降低线形DNA的密度 ⑵ 碱裂解法 pH12（NaOH和SDS） 染色体DNA片段变性解链； 质粒DNA部分解链 将pH调回中性(乙酸钾) 变性的染色