[医药卫生]11储迅涛-感染性疾病的确认试验.pdf

感染性疾病血清学检验 的确认试验 储迅涛博士 为什么要做确认试验 免疫测定结果可能出现假阳性 在感染性疾病血清学检验常用的定性ELISA试验 中，测定样本的A值≥Cut-off （反应性），但 样本中可能并不存在病原体的特异性抗体或抗原 通过确认试验证实样本中存在病原体的特异性抗 体或抗原，才可报告结果为阳性 导致假阳性的因素 阳性判断值（Cut-off ）的设定 内源性干扰 外源性干扰 试剂质量和实验操作的不精密度 灰区（GREY ZONE ） 在免疫测定中，按Cut-off确定 结果为阳性或阴性时，有一个可能 出现假阳性或假阴性的范围。这个 范围与试剂的质量有关，应由试剂 生产单位在确定Cut-off值时确定， 需要时在说明书中注出。 灰区的确定 阴性Cut-off和阳性Cut-off之间的区域 阴性标本5000份 均值0.06 标准差0.019 Cut-off 0.11 (99.5%可信限) 阳性标本2000份 均值1.50 标准差0.628 Cut-off 0.08 (99.5%可信限) ELISA测定的“灰区确定” 内源性因素 补体 高浓度的非特异性免疫球蛋白 嗜异性抗体 某些自身抗体 外源性因素 标本溶血：血红素基团有类似过氧化物的活性 标本污染：细菌的内源性酶会产生非特异性干扰 标本贮存时间过长：标本在2~8℃下保存时间过 长，IgG可聚合成多聚体，在间接法ELISA测定 中会导致本底过深，甚至造成假阳性 标本凝固不全：血液通常30分钟开始凝固，18~ 24小时完全凝固，日常检验时血液还没有完全凝 固就分离血清，此时分离出的血清中残留部分纤 维蛋白原，检测结果易造成假阳性 试剂盒原材料的纯度、组合、来源等也会造成结 果的假阳性或假阴性 其它因素 测定方法的不精密度 实验操作、样本采集、样本前处理、 试剂质量等诸多因素 人类免疫缺陷病毒(HIV) 抗体的确认 常用的HIV抗体筛查方法 酶免疫测定（ELISA ） 明胶颗粒凝集试验（PA ） 金(硒)标记快速免疫测定 化学发光免疫测定 HIV抗体筛查方法存在的问题 在窗口期抗-HIV 不能被检测到(1-3 月) 在窗口期有“假阴性”结果 假阳性有66种可能: 肝病、输血制品等 错误的实验室操作 试剂质量的问题 HIV抗体的确认方法 蛋白印迹试验（WB ） 免疫荧光抗体测定（IFA ） 免疫荧光抗体测定（IFA ） 在包被了HIV抗原的玻片上加上血清 孵育后，冲洗玻片，移去剩余血清 在玻片上加上抗人荧光抗体 孵育后, 在显微镜下观查荧光反应 当抗人荧光结合物加入后，HIV感染细胞可显示 HIV荧光抗原 优点：没有不确定的结果，在室内90分钟内可完 成HIV检测 蛋白印迹试验（WB ） 最常用的HIV抗体确认方法 ELISA 阳性仅提示HIV抗体存在的可能性 蛋白印迹试验通过在膜上的抗原直接识别HIV抗体 缺陷： 工作强度高, 需运行较长时间 判断标准没有标准化 与ELISA 相比蛋白印迹法特异性高但敏感性低 因窗口期、晚期或抗体交叉反应等原因，可造成蛋白印迹 法的判断不确定 蛋白印迹试剂的制备 HIV病毒裂解及蛋白抗原的纯化 SDS垂直凝胶电泳 转移(凝胶到硝酸纤维素膜) 加样 切割 蛋白印迹试验的原理 洗