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[医药卫生]THE BASIS OF REAL TIME PCR
;提 要;欧比特仪器有限公司是ABI在中国内地的唯一授权经销商;AB —三大Nobel 获奖技术的拥有者 !!! ;荧光定量PCR原理;;PCR动力学曲线和四个阶段;如何对起始模板定量?
通过Ct值和标准曲线实现对起始模板的定量分析
一个方程:
PCR理论方程
两个概念:
荧光阈值、Ct值
;lg [DNA];什么是荧光阈值?;什么是CT值?;定量PCR的化学原理;两种化学;SYBR?Green I 染料法; SYBR Green I 染料发光特性;Denaturation;数量关系;染料法的局限性及ABI提供的解决方案;熔解曲线(Dissociation curve);特异PCR的融解曲线;非特异PCR的融解曲线;染料法的局限性及AB提供的解决方案;PowerSYBR? Green PCR Master Mix AmpliTaq Gold LD polymerase;染料法的局限性及ABI提供的解决方案;TaqMan序列特异探针法;TaqMan探针法;;;;No fluorescent
signal (emission)
from reporter;荧光共振能量转移(FRET);Light energy;TaqMan? in action . . .;;;Taq comes in . . .;;;;;;Taq is special . . .;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;TaqMan 探针法之数量关系;TaqMan探针法定量的特点;AB解决方案——TaqMan? Gene Expression Assays;AB解决方案——TaqMan? Arrays;384-Well TaqMan? Gene Signature Array; TaqMan? Gene Expression Master Mix
;荧光定量PCR数据分析;荧光定量PCR的定量方法;CT值 ? [DNA]0 ;绝对定量(绝对标准曲线法);绝对定量:绝对标准曲线法;绝对定量——实验设计;荧光定量PCR的定量方法;相对标准曲线法:目的基因和管家基因都要做标准曲线; 相对标准曲线法数据分析;相对标准曲线法——实验设计; Nn = N0 (1+E)n
NCT = N0 (1+E)CT
当E = 100% = 1时,1+E = 2
NCT = N0 2CT
N0 = NCT 2 -CT
所以,
N01/N02 = NCT1/NCT2 2 –(CT1– CT2) = 2 – ΔCT ( 1,2代表两组实验对象)
用内参进行校正
(N01/N01内)/ (N02/N02内)= (2 – ΔCT1) / (2 – ΔCT2)
=2 –(ΔCT1– ΔCT2) = 2 –ΔΔCT2 ;假设目的基因与管家基因扩增效率相同且为100%,数学推导得出
目的基因的相对含量=2-ΔΔCt
即实验组目的基因的表达量相对于对照组的变化倍数
ΔΔCt=(Ct目的基因-Ct管家基因)实验组-(Ct目的基因-Ct管家基因)对照;比较Ct值法分析(不同处理时间);比较Ct值法分析(不同类型组织);ABI Prism SDS Software -RQ Study;适宜:多基因、大样本,低差异
每个样本必须同时做目的基因和管家基因
---需要验证目的基因和管家基因的扩增效率是否相同且为100%
ΔE (between target and reference gene) = 0.03, the difference in expression ratio is 46% (Etarget Eref) and 209% (Etarget Eref)
ΔE = 0.05, 27% and 338%
ΔE = 0.10, 7.2% and 1083% (Pfaffl et al., 2002)
---PCR扩增片段长度150bp
优点:不需要做标准品;应用广泛
困难:需要大量前期的优化工作
所有ABI TaqMan? Gene Expression Assays的扩增效率均为100%,无须条件优化及扩增效率的验证。;定量PCR的应用;ABI荧光定量PCR技术的应用;SNPs (Single Nucleotide Polymorphisms) 单一碱基序列多态性;概述;SNP研究意义;;TaqMan?MGB探针SNP分型原理;C;FAM纯合子;探针???;两种探针效果比较;AB解决方案——MGB探针;2 条引物+2条TaqMan?MGB探针(VI
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